pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel
Summary
Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.
Abstract
Verstehen Membranprotein Handel, Montage und Ausdruck erfordert einen Ansatz, der zwischen die Personen mit Wohnsitz in intrazellulären Organellen und die lokalisierte auf der Plasmamembran unterscheidet. Traditionelle fluoreszenzbasierte Messungen fehlt die Fähigkeit Membranproteinen zu unterscheiden in unterschiedlichen Organellen befinden. Modernste Methoden überwinden traditionellen Methoden durch pH-sensitive Fluorophore mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) Kopplung. TIRF Beleuchtungs regt die Probe bis zu etwa 150 nm von der Glasprobe Schnittstelle, wodurch Hintergrund abnimmt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und zu verbessern Auflösung. Das Anregungsvolumen in TIRFM umfasst die Plasmamembran und in der Nähe Organellen wie die periphere ER. Superecliptic pHluorin (SEP) ist ein pH-empfindliche Version von GFP. Genetisch September kodiert, in die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins von Interesse positioniert das Fluorophor aufdie luminale Seite des ER und in der extrazellulären Region der Zelle. SEP fluoreszierend, wenn der pH-Wert größer als 6 ist, sondern bleibt in einem Aus-Zustand bei niedrigeren pH-Werten. Daher Rezeptoren SEP fluoreszieren markiert, wenn in dem endoplasmatischen Reticulum (ER) oder beim Einführen in die Plasmamembran (PM) aufhalten, jedoch nicht, wenn sie einer Handel Vesikel oder andere Organellen wie der Golgi beschränkt. Die extrazelluläre pH kann eingestellt werden, um die Fluoreszenz von Rezeptoren auf der Plasmamembran zu diktieren. Der Unterschied in der Fluoreszenz zwischen TIRF Bilder bei neutralen und sauren extrazellulären pH-Wert für die gleiche Zelle entspricht einer relativen Anzahl von Rezeptoren auf der Plasmamembran. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Messung von intrazellulären und Plasmamembran-Rezeptoren resident. Single Vesikel Insertionsereignisse kann auch gemessen werden, wenn der extrazelluläre pH neutral ist, entsprechend einem niedrigen pH Handel Vesikel mit der Plasmamembran verschmelzen und in einen fluoreszierenden Zustand übergeht. Diese versatilE-Technik kann die Lokalisierung, Ausdruck und Handel von Membranproteinen zu untersuchen ausgenutzt werden.
Introduction
Veränderungen der Rezeptor – Expression, Verteilung und Anordnung haben zu einer Vielzahl von Krankheiten verbunden ist, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, zystischer Fibrose und Drogenabhängigkeit 1, 2, 3, 4, 5. Zum Beispiel beeinflussen Nikotin und andere Nikotinliganden des Handels mit nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) , was zu Veränderungen in Handel, Ausdruck und upregulation 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nikotin erhöht sich die Gesamtzahl der zusammengesetzten nAChRs innerhalb einer Zelle erhöht Handel in Richtung der Plasmamembran, eind ändert die Montage von Untereinheiten eine hohe Empfindlichkeit Version einiger Subtypen zu begünstigen. Beheben von deutlichen Veränderungen in Handel, Montage und Expression von Rezeptoren in einem Krankheitsmodell liefert wichtige mechanistische Details, die Droge wesentlich sind Ziele zu definieren. Ein idealer Ansatz würde zwischen intrazelluläre Rezeptoren und diejenigen, lokalisiert auf der Plasmamembran schnell unterscheiden. Dies ist besonders anspruchsvoll in Fällen, in denen eine Mehrheit eines bestimmten Proteins intrazellulär befindet, wie mit nAChRs. Da die Mehrheit der nAChR zum endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind, fehlt traditionelle Messungen die räumlich-zeitliche Auflösung erforderlich Lokalisierung und -handel Veränderungen entlang des sekretorischen Weg zu lokalisieren. Receptor Handel und Expressionsstudien von nAChR wurden in erster Linie durchgeführt unter Verwendung von Radioligand 11 Bindung, Biotinylierung Assays 12, Western – Blot – 13 oder Immunpräzipitation techniq ues 12. Diese sind abhängig von der Bindungsspezifität eines Reportermoleküls oder Fixierung der Zellen und fehlt die Fähigkeit, gleichzeitig zwischen Plasmamembran resident und intrazelluläre Rezeptoren unterscheiden. Daher haben Studien an Ionenkanalanordnung und Vesikel Dynamik weitgehend stützte sich auf niedrigem Durchsatz elektro Techniken 14.
Superior räumliche und zeitliche Auflösung ist möglich, mit den Fortschritten in der Fluoreszenzmikroskopie. Genetisch kodierte Reportermoleküle, wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) und dessen Varianten, unspezifische Bindung Probleme beseitigen und 15 Empfindlichkeit erhöhen. Eine pH – empfindliche Variante von GFP, wie superecliptic pHluorin (SEP) bekannt ist , kann verwendet werden , um inhärente Unterschiede zwischen pH Kompartimenten innerhalb einer Zelle auszunutzen Lokalisierungs 5, 7, 8, um zu bestimmen ,ref "> 9, 16, 17, 18. fluoresziert September , wenn der pH – Wert höher als 6 ist, aber bei niedrigeren pH – Wert in einem Aus – Zustand bleibt. Daher SEP markierten Rezeptoren auf ihrer luminalen Seite , wenn sie in das endoplasmatische Retikulum detektiert werden ( ER) oder beim Einführen in die Plasmamembran (PM), aber nicht, wenn sie einer Handel Vesikel eingeschlossen. Manipulation der extrazellulären pH in Kontakt mit Rezeptoren auf der Plasmamembran ändert folglich die Fluoreszenz und damit Nachweis dieser Rezeptoren. Wenn die gleiche Zelle sequentiell sowohl bei einem neutralen extrazellulären pH abgebildet wird und dann einen pH – Wert niedriger als 6 ist , die Differenz zwischen den Bildern an Rezeptoren auf der Plasmamembran zurückgeführt wird. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Messung von intrazellulärem (peripheral ER) und Plasmamembran resident Rezeptoren 5, 7, 8 </sup>, 9. Einzelne Vesikel Insertion Ereignisse können auch aufgelöst werden, wenn der extrazellulären pH neutral ist. Wenn ein niedriger pH Handel Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt, wird der luminalen Seite des Vesikels in die neutrale extrazellulären Lösung ausgesetzt wird , einen Übergang als Burst von Fluoreszenz nachgewiesen verursacht 7, 18, 19, 20. September ermöglicht die Messung von Rezeptoren auf der Plasmamembran und peripheren endoplasmatischen Retikulum lokalisiert und stellt ein Mittel Handel von Rezeptoren zwischen diesen subzelluläre Bereiche 5 zu messen, 7, 18.
Um eine höhere Auflösung in der Plasmamembran zu erreichen, ein Rezeptor SEP genetisch kodiert wird durch innere Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) abgebildet. Dieses Verfahren ist insbesonderenützlich, wenn die Mehrheit der Rezeptoren an intrazelluläre Regionen lokalisiert, da TIRFM erhöht die Sichtbarkeit der Plasmamembran. TIRFM ermöglicht auch die Auflösung des Menschenhandels Dynamik einzelner Vesikel September-markierten Rezeptoren beim Einsetzen in die PM trägt. Eine innere Totalreflexion tritt mit unterschiedlichen Brechungsindizes an der Grenzfläche von Materialien, wie beispielsweise zwischen einer Zelle und einem Glasdeckglas 21, 22. September fluoresziert, wenn es mit 488 nm Anregung bestrahlt, die ausgerichtet ist, eine innere Totalreflexion an der Grenzfläche des Glases und Zelllösung zu erreichen. Dadurch ergibt sich eine abklingende Welle, die etwa 150 nm in die Probe eindringt, nur spannende Fluorophore innerhalb dieses Volumens. Nur September Rezeptoren in einem neutralen pH-Umgebung innerhalb dieses Bereichs von Anregungs werden enthaltenden detektiert, die denen entsprechen, auf der Plasmamembran oder peripheren endoplasmatischen Retikulum befinden. Da Erkennung begrenzt to Anregung durch die abklingende Welle, die Hintergrundfluoreszenz von der intrazellulären Region verringert und das Signal – Rausch – Verhältnis 21 erhöht, 22. Darüber hinaus, da Strahlung nicht den Großteil der Zelle nicht durchdringen, wird Lichtschäden minimiert die Bildgebung im Laufe der Zeit lebenden Zellen erlaubt. Als Ergebnis gekoppelt TIRFM mit genetisch kodierten September bietet die hohe Auflösung und Empfindlichkeit erforderlich subzelluläre Lokalisation und -handel Dynamik von Membranrezeptoren entlang des sekretorischen Weg zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die pH – Empfindlichkeit SEP ermöglicht Rezeptoren auf der Plasmamembran wohn aus intrazellulären Rezeptoren im endoplasmatischen Retikulum zu unterscheiden, und es kann verwendet werden , um Einfügungs Ereignisse von Rezeptor-tragenden Vesikeln 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 zu lösen . Verschi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60x, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25×36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
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