ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים
Summary
מערכות Nonlytic ביטוי תא חרקים הם מנוצלים לייצור, סחר / לוקליזציה הסלולר, וניתוח פונקציונלי חלבון רקומביננטי. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת וקטורי ביטוי והבעת חלבון חולפת עוקבת בשורות תא פרפראים זמינות מסחרי. שיתוף הלוקליזציה של aquaporins tabaci Bemisia עם חלבונים בסמן פלורסנטי התת-תאי מוצגת גם.
Abstract
מערכות חלבון ביטוי Heterologous משמשות לייצור חלבונים רקומביננטיים, הפרשנות של סחר / לוקליזציה הסלולר, ואת הנחישות של הפונקציה ביוכימית של חלבונים ברמה תת-אורגניזמים. למרות שמערכות ביטוי baculovirus משמשות יותר ויותר לייצור חלבון ביוטכנולוגית רבה, תרופות, ויישומים תעשייתיים, מערכות nonlytic שאינו כרוכות זיהום ויראלי יש יתרונות ברורים, אבל הם לעתים קרובות התעלמו ו מנוצלים. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת וקטורי ביטוי nonlytic וביטוי חלבונים רקומביננטיים חולף. פרוטוקול זה מאפשר לוקליזציה הסלולר היעילה של חלבונים רקומביננטיים וניתן להשתמש בו כדי להבחין סחר חלבון במהירות בתוך התא. אנחנו מראים את הביטוי של ארבעה חלבונים רקומביננטיים בקו תא חרק זמין מסחרי, לרבות שני חלבוני aquaporin מן tabaci Bemisia החרקים, כמו גםכמו חלבוני סמן התת-תאי ספציפיים עבור הממברנה תא עבור lysosomes התאי. כל החלבונים רקומביננטי הופקו כמו מפלצות עם סמנים חלבון פלואורסצנטי ב Termini carboxyl שלהם, המאפשר זיהוי ישיר של חלבונים רקומביננטיים. Transfection הכפול של תאים עם פלסמידים מחסה בונים עבור הגנים של ריבית סמן התת-תאי ידוע מאפשר הדמית תא חייה ואימות משופרת של לוקליזציה חלבון הסלולר.
Introduction
ייצור חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכות ביטוי תא חרק מציע יתרונות רבים ללימוד חלבונים איקריוטיים. כלומר, תאי חרקים בעלי שלאחר translational שינויים דומים, עיבוד, ומנגנוני מיון כמו הנוכחים בתאי יונקים, המהווה יתרון לייצור חלבוני 1 מקופל כראוי, 2, 3. גם מערכות תא חרקים בדרך כלל דורשים פחות משאבים ופחות זמן ומאמץ לצורך תחזוקה מ שורות תאים יונקים 4, 5. מערכת ביטוי baculovirus היא מערכת מבוססת תא חרק אחד כזה, כי הוא עכשיו בשימוש נרחב בתחומים רבים, כוללים הייצור של חלבונים רקומביננטיים עבור ואפיון חלבונים ותרופות, מצגת immunogenic של פפטידים זרים וחלבונים נגיפיים לייצור חיסון, הסינתזה של רב מתחמי -protein, ייצור של חלבונים glycosylated, וכו. 1, 2, 4, 6. יש, עם זאת, במצבים בהם ביטוי baculovirus לא יכול להיות ישים 3, 7, ושימוש במערכות ביטוי חרקים nonlytic וחולפת עשוי להיות מתאים יותר. באופן ספציפי, ביטוי תא חרק חולף מציע את האפשרות לסינתזה המהירה של חלבון רקומביננטי, דורש פחות פיתוח ותחזוקה, אינו כרוכות ימסו תא ויראלי שהוטל, ומספק אמצעי ללמוד סחר הסלולר טוב יותר במהלך חלבון סינתזה 7, 8, 9, 10.
פרוטוקול זה מתאר את הדור המהיר של וקטורי ביטוי באמצעות הארכת חפיפת שני שלבי PCR (OE-PCR) <sup class = "Xref"> 11 ואת שיבוט רמת DNA פלסמיד coli Escherichia. פלסמידים משמשים-transfect הכפול זמינים מסחרי תאי חרק מתורבתים כדי לייצר חלבוני נציג. הפרוטוקול מתאר את ייצור ושימוש שני חלבונים שונים fluorescently שכותרתו התת-תאי סמן ומדגים colocalization עם שני חלבונים aquaporin מן tabaci Bemisia חרקים. הפרוטוקול הבא מספק את המתודולוגיה הבסיסית עבור OE-PCR, תחזוקת תא חרקי transfection, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הלוקליזציה של חלבוני יעד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכות ביטוי חלבון Heterologous הם כלים חשובים לייצור חלבונים רקומביננטיים בשימוש ביישומים במורד הזרם רבים 4. בחירה ממערכות ביטוי המגוונות הזמינות תלוי בסופו של דבר המטרה של החלבון של עניין. כמה מערכות תא ביטוי חרק זמינות המציעים חלופות גמישות למערכות ביטוי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לין Forlow-Jech ו Dannialle לירוי לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מימון שקריס הבסיס USDA ARS, התכנית הלאומית 304 – להגנת הצומח ההסגר [פרויקט # 2020-22620-022-00D] להזכיר JAF ו JJH של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה הוא אך ורק לשם מתן מידע ספציפי ואינו משתמע המלצה או תמיכה על ידי משרד החקלאות האמריקני. USDA היא ספקית הזדמנות שווה מעסיק.
Materials
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. , 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
