培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在
Summary
Nonlytic昆虫細胞発現系は、生産、細胞輸送/ローカリゼーション、および組換えタンパク質機能解析のために十分に活用されています。ここでは、市販の鱗翅目の細胞株で発現ベクターおよびそれに続く一過性のタンパク質発現を生成する方法について説明します。細胞内蛍光マーカータンパク質とタバココナジラミのアクアポリンの共局在も提示されています。
Abstract
異種タンパク質発現系は、組換えタンパク質の産生のために使用され、細胞輸送/局在の解釈、および副生物レベルでタンパク質の生化学的機能の決意。バキュロウイルス発現系は、ますます多数の生物工学、製薬、および産業用アプリケーションでのタンパク質生産のために使用されているが、ウイルス感染を伴わないnonlyticシステムは、明確な利点を持っていますが、見落とされがちと十分に活用されています。ここでは、nonlytic発現ベクターおよび過渡組換えタンパク質発現を生成する方法について説明します。このプロトコルは、組換えタンパク質の効率的な細胞内局在を可能にし、急速に細胞内タンパク質輸送を識別するために使用することができます。我々としても、虫タバココナジラミから2つのアクアポリンタンパク質を含む市販の昆虫細胞株の4つの組換えタンパク質の発現を示します細胞原形質膜のための特定の細胞内マーカータンパク質として細胞内リソソームのため。全ての組換えタンパク質は、組換えタンパク質の直接検出を可能にするそれらのカルボキシル末端にて蛍光タンパク質マーカーとのキメラとして製造しました。関心公知の細胞内マーカーの遺伝子についての構築物を保有するプラスミドを用いた細胞の二重トランスフェクションは、生細胞イメージングと細胞タンパク質局在化の改善された検証を可能にします。
Introduction
昆虫細胞発現系を用いた組換えタンパク質の生産は、真核生物のタンパク質の研究のための多くの利点を提供しています。すなわち、昆虫細胞は、適切に折り畳まれたタンパク質1、2、3を製造するために有利であり、同様の翻訳後修飾、プロセシング、および哺乳動物細胞中に存在するもののようなメカニズムをソートを有します。昆虫細胞系もまた、典型的には、哺乳動物細胞株4、5よりもメンテナンスのために、より少ないリソースとより少ない時間と労力を必要とします。バキュロウイルス発現系はタンパク質の特徴付けおよび治療のための組換えタンパク質の産生、ワクチン製造のための外来ペプチドおよびウイルスタンパク質の免疫原プレゼンテーション、マルチの合成を含む現在広く多くの分野で使用されているそのような昆虫細胞ベースのシステムであります – タンパク質複合体、グリコシル化タンパク質などの生産。 1、2、4、6。しかしながら、状況とは、バキュロウイルス発現は3,7適用できないかもしれない、そしてnonlytic及び一過性昆虫発現系の使用がより適切であり得ます。具体的には、過渡的な昆虫細胞発現は、組換えタンパク質の迅速な合成のための可能性を提供し、ウイルスに課せられた細胞溶解を伴わない以下の開発とメンテナンスを必要とし、より良いタンパク質合成7、8、9時の細胞輸送を研究するための手段を提供し、 10。
このプロトコルは、2段階オーバーラップ伸長PCR（OE-PCR）を用いて、発現ベクターの迅速な生成を記載しています<suPクラス=「外部参照」> 11と大腸菌におけるプラスミドDNAの標準的なクローニング。プラスミドは、二重トランスフェクト市販の昆虫培養細胞に使用され、代表的なタンパク質を産生します。プロトコルは、2つの異なる蛍光標識細胞内マーカータンパク質の生産と使用を説明し、虫タバココナジラミから2つのアクアポリンタンパク質と共局在を示しています。以下のプロトコルは、OE-PCR、標的タンパク質の細胞局在のための昆虫細胞の維持およびトランスフェクション、および蛍光顕微鏡検査のための基本的な方法論を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
異種タンパク質発現系は、多くの下流の用途4で使用される組換えタンパク質の生産のための重要なツールです。利用できる多様な発現系から選択することが目的のタンパク質のための最終的な目標に依存します。いくつかの昆虫細胞発現系は、原核生物と真核細胞発現系5、6への柔軟な選択肢を提供しているご利用いただけます?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、技術支援のためのリンForlow-Jechとダンニアル・リロイ感謝します。この記事は目的のためだけであるに商号または商用製品のJAFとJJH言及する農薬や検疫[プロジェクト＃2020-22620-022-00D] – この作品は、USDA ARSにベースCRIS資金、国家プログラム304によってサポートされていました具体的な情報を提供し、米国農務省による推薦または保証を意味するものではありません。 USDAは機会均等プロバイダーおよび雇用主です。
Materials
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. , 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
