Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme
Summary
Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.
Abstract
Heterolog protein ekspresyon sistemler, rekombinant proteinlerin üretimi için kullanılan, selüler trafik / lokalizasyonu yorumlanması ve alt organizma seviyesinde protein biyokimyasal fonksiyonunun belirlenmesi. bakulovirüs ifade sistemleri giderek sayısız biyoteknolojik, ilaç ve endüstriyel uygulamalar, var açık yararlar viral enfeksiyon içermeyen ama çoğu zaman göz ardı ve kullanılamayan ama nonlytic sistemlerde protein üretimi için kullanılmasına rağmen. Burada, nonlytic ekspresyon vektörleri ve geçici rekombinant protein ekspresyonunu oluşturmak için bir yöntem tarif eder. Bu protokol, rekombinant proteinlerin etkin hücresel lokalizasyonu için izin verir ve hızlı bir şekilde hücre içinde protein trafiğini ayırt etmek için kullanılabilir. Biz de, böcek Bemisia tabaci iki aquaporin proteinler de dahil olmak üzere, ticari olarak mevcut böcek hücresi hattı dört rekombinant proteinlerin ekspresyonu gösterirHücre plazma zarının spesifik hücre içi markör proteinler olarak ve hücre içi lizozomlar için. Yeniden birleştirici tüm proteinler rekombinant proteinlerin doğrudan teşhis edilmesine izin verir, karboksil terminallerinde, floresan protein işaretleri ile kimeraları üretildi. plazmidler ilgi ve bilinen bir alt hücresel markör genler için konstruktlarını barındıran hücrelerin çift transfeksiyon canlı hücre görüntüleme ve hücresel protein lokalizasyonu geliştirilmiş doğrulama sağlar.
Introduction
böcek hücresi ifade sistemleri kullanılarak, rekombinant proteinlerin üretimi ökaryotik proteinlerin çalışma için sayısız avantajlar sunmaktadır. Yani, böcek hücreleri de benzer post-translasyonel modifikasyonları, işleme ve uygun biçimde katlanmış proteinler, 1, 2, 3 üretilmesi için avantajlı olan memeli hücrelerinde mevcut olanlar gibi ayırma mekanizmalara sahiptirler. Böcek hücre sistemleri, aynı zamanda, tipik olarak memeli hücre çizgileri 4, 5 den bakım için daha az kaynak ve daha az zaman ve çaba gerektirir. bakulovirüs ekspresyon sistemi, protein karakterizasyonu ve terapötik, yabancı peptidler ve aşı üretimi için viral proteinlerin imünojenik sunumu, çok sentezi için rekombinant proteinlerin üretimi de dahil olmak üzere artık birçok disiplinlerde kullanılan bir böcek hücre bazlı bir sistem, bir proteini kompleksleriVb glikosile proteinlerin üretimi. 1, 2, 4, 6. Bununla birlikte, çeşitli durum da baculovirüs ifade 3, 7 uygulanabilir olmayabilir ve nonlytic ve geçici böcek ifade sistemlerinin kullanılması daha uygun olabilir. Özellikle, geçici böcek hücresi ekspresyon rekombinant proteinin hızlı sentezi için imkanı sunar, viral-uygulanan hücre lizizi içermeyen az gelişim ve bakım gerektirir ve daha iyi bir protein sentezi 7, 8, 9 boyunca hücre hareketini incelemek için bir araç sağlar, 10.
Bu protokol kullanılarak ekspresyon vektörlerinin hızla oluşturulmasını tarif etmektedir, iki aşamalı üst üste gelen uzatma PCR ile (OE-PCR) <sup class = "xref"> 11 ve Escherichia coli içinde plazmid DNA standart klonlama. Plazmidler, çift transfekte ticari olarak temin edilebilen Kültürlenmiş böcek hücreleri kullanılır ve temsili proteinleri üretmek için. Protokol, iki farklı floresan etiketli hücre içi işaretleme proteinleri üretim ve kullanımını tarif eder ve böcek Bemisia tabaci iki aquaporin proteinleri ile ko göstermektedir. Aşağıdaki protokol, OE-PCR, hedef proteinlerin hücresel lokalizasyon amacıyla böcek hücre bakım ve transfeksiyon, ve floresan mikroskobu için temel bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heterolog protein ekspresyon sistemleri çok sayıda alt uygulamalarda 4'te kullanılan rekombinant proteinlerin üretimi için önemli bir araçtır. Mevcut çeşitli ifade sistemlerinden seçme ilgi protein için nihai hedef bağlıdır. Çeşitli böcek hücresi ifade sistemleri prokaryotik ve ökaryotik hücre ekspresyon sistemleri 5, 6 esnek alternatifler sunan mevcuttur. Protein ifadesini sürmek için bakulovirüs enfeksiyonu g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz teknik yardım için Lynn forlow-JECH ve Dannialle LeRoy teşekkür ederim. Bu makale amacıyla sadece bir ticaret adları veya ticari ürünlerin JAF ve JJH Mansiyon için Bitki Koruma ve Karantina [Proje # 2020-22620-022-00D] – Bu çalışma USDA ARS taban -CRIS fon, Ulusal Program 304 tarafından desteklenmiştir spesifik bilgi sağlama ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işverendir.
Materials
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. , 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
