Effets d’allogéniques Plasma riche en plaquettes (PRP) sur le processus de guérison des Tendons d’Achille sectionné des Rats : une Description méthodologique
Summary
Ce protocole décrit le processus d’évaluation de la guérison des tendons chez les rats qui ont reçu une injection de plasma riche en plaquettes allogéniques (PRP) ou une solution saline après avoir enlevé la partie du tendon d’Achille. L’état d’avancement de la guérison du tendon est évalué à plusieurs points dans le temps à l’aide de différents types d’analyses.
Abstract
Cet article décrit les procédures expérimentales utilisées pour observer si PRP peut influencer positivement la guérison du tendon. Il y a 4 grandes étapes à suivre : induire une lésion dans le tendon d’Achille ; préparer des PRP et injecter (ou la solution saline) ; supprimer le tendon ; et effectuer des évaluations biomécaniques, moléculaires et histologiques. A chaque étape, toutes les procédures et les méthodes sont décrites en détail, donc ils peuvent être facilement reproduits.
Tendons d’Achille ont été sectionnée chirurgicalement (suppression d’un tronçon de 5 mm de long). Par la suite, PRP ou une solution saline a été injectée pour étudier si le PRP a un effet positif sur la guérison du tendon. Trois groupes de 40 animaux (un total de 120 rats ont été utilisés dans cette étude) ont été divisés en 2 sous-groupes : groupe d’injection de PRP et une injection saline groupe témoin. Des rats ont été sacrifiés à accroître les points dans le temps (groupe A: 5 jours ; Groupe B: 15 jours ; Groupe C: 30 jours) et les tendons ont été supprimés. 90 tendons ont subi des tests biomécaniques avant d’effectuer l’analyse transcriptomique et les 30 tendons restants ont été soumis à une analyse histologique.
Introduction
Coagulation, processus inflammatoires et les rôles de modulation de l’immunité des plaquettes sont bien connu1. Plus récemment, il a été démontré qu’ils ont aussi des propriétés réparatrice2,3. En effet, divers facteurs de croissance et cytokines (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I et HGF) sont libérés par les plaquettes au cours de la dégranulation. Ces facteurs de croissance favorisent l’angiogenèse, remodelage tissulaire et plaie de guérison (OS, peau, muscle, tendon)2. Centrifugation de sang autologue produit plasma riche en plaquettes (PRP) qui contient des concentrations de plaquettes élevé selon la méthode d’isolement (entre 3 et 10 fois les concentrations initiales de sang). En effet, les différentes techniques de préparation de PRP ne peut pas fournir un produit final identique. Jusqu’à présent, il n’y a eu aucun accord international général sur cette question. Dans l’ensemble, le PRP pourrait être une option thérapeutique intéressante pour le traitement des troubles musculo-squelettiques chroniques, comme la tendinopathie, fasciite plantaire, l’arthrose et non syndiqué4. Il a été utilisé pour la première fois en chirurgie buccale et implantologie4 pour améliorer et accélérer les os guérison après avoir placé un implant dentaire. Dans cette étude, nous décrivons une méthode reproductible qui permet l’acquisition de la PRP pour l’expérimentation animale4.
Étant donné que les lésions des tendons sont fréquemment observées dans les sportifs et les travailleurs physiques, amélioration du processus de guérison et réduisant ainsi le temps de récupération sont de grand intérêt5. Nouvelles méthodes de traitement qui sont développent souvent impliquent l’utilisation de facteurs de croissance, et l’administration de la PRP est un moyen simple et peu invasif à offrir un mélange de facteurs de croissance endogène4.
Plusieurs études in vitro ou animal ont démontré que l’administration de plasma contenant un niveau élevé de plaquettes, en libérant des médiateurs biologiques, peut stimuler la réparation de tendon et ligament en libérant des médiateurs biologiques6 ,7,8,9. En outre, les autres études ont montré que le PRP peut stimuler type I et la synthèse du collagène III dans tendon cellules9,10,11. Il a également été suggéré que le PRP peut diminuer l’activation des métalloprotéinases matricielles (MMP) et par conséquent réduire la dégradation de la matrice. Les cellules qui sont impliqués dans le processus d’inflammation peuvent produire de MMP-9, qui joue un rôle dans le tissu remodelage (physiologiques et pathologiques) induite par l’inflammation12.
Basé sur cette information, nous avons supposé qu’une seule injection de PRP dans les tendons d’Achille sectionnés des rats pourrait améliorer le processus de récupération et de la résistance mécanique des tissus réparés. Ceci a été testé en mesurant les propriétés biomécaniques des tendons guérison pendant le processus de récupération et en faisant des analyses histologiques et moléculaires pour évaluer le collagène transformant dans le tissu nouvellement formé. L’objectif de cette étude était d’observer si une seule injection de PRP allogénique pourrait influer sur la cicatrisation des tendons d’Achille sectionnés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les plaquettes sont essentiels à la phase précoce et inflammatoire du tendon processus de guérison. Lorsque ces plaquettes sont exposés à liant les tissus ou les facteurs qui induisent la coagulation, ils vont sortir des facteurs de croissance qui sont stockées dans les granules α. En raison de cette interaction, macromolécules de la matrice extracellulaire sont synthétisée et prolifèrent des cellules mésenchymateuses. Les plaquettes ont aussi une activité chimiotactique sur cellules progénitrices dans la c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par le Standard de Liège et Lejeune – Lechien accorde des Fonds Léon Frédéricq.
Materials
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -. C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. Sample size determination. ILAR J. 43, 207-213 (2002).
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -. F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -. F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
