Эффекты аллогенной тромбоцитов богатые плазмы (PRP) на процесс заживления секционного ахиллова сухожилия крыс: методологическое описание
Summary
Этот протокол описывает процесс оценки исцеления сухожилия в крыс, которые были введены с аллогенной тромбоцитов богатой плазмы (PRP) или физиологический раствор после удаления части ахиллова сухожилия. Ход лечения сухожилия оценивается в нескольких точках времени, с использованием различных видов анализа.
Abstract
Эта статья описывает экспериментальной процедуры, используемые для наблюдения, если PRP могут позитивно влиять на сухожилие исцеления. Есть 4 основные шаги, чтобы следовать: вызывают поражения в ахиллова сухожилия; подготовить PRP и вставляют его (или физиологический раствор); удалите сухожилия; и выполнять биомеханических, молекулярной и гистологической оценок. На каждом шаге все процедуры и методы описаны в деталях, так что они могут быть легко воспроизведены.
Ахиллова сухожилия были хирургически секционного (Удаление секции длиной 5 мм). Впоследствии ОТР или физиологический раствор был введен для изучения ли PRP имеет положительное влияние на исцеление сухожилия. Три группы 40 животных (в общей сложности 120 крыс были использованы в этом исследовании) были разделены на 2 подгруппы: PRP инъекции группы и солевые впрыск управления группы. Крысы были принесены в жертву на увеличение времени точек (Группа A: 5 дней; Группа B: 15 дней; Группа C: 30 дней) и сухожилий, были удалены. 90 сухожилий прошли биомеханические тестирования перед выполнением анализа транскриптомики и 30 оставшихся сухожилий были представлены гистологический анализ.
Introduction
Хорошо известно1коагуляции, воспалительные процессы и иммунитет модуляция функции тромбоцитов. Совсем недавно было продемонстрировано, что они также имеют реституционного свойства2,3. Действительно, различные факторы цитокинов и роста (VEGF, PDGF, TGF-Б, IGF-I и HGF) выпускаются тромбоцитов во время дегрануляции. Эти факторы роста содействовать ангиогенеза, тканей ремоделирования и раны исцеление (кости, кожу, мышцы, сухожилия)2. Центрифугирование аутологичной крови производит тромбоцитов богатой плазмы (PRP) который содержит тромбоцитов высокой концентрации в зависимости от метода изоляции (между 3 и 10 раз крови концентрации исходных условий). Действительно различные методы приготовления ОТР не может обеспечить идентичные конечного продукта. До сих пор был международного общего согласия по этому вопросу. В целом ОТР может быть привлекательным терапевтического лечения хронического опорно-двигательного аппарата, например плеча, подошвенный фасциит, артроз и исправления4. Он был использован в первый раз в оральной хирургии и имплантологии4 для улучшения и ускорения заживления после размещения стоматологических имплантатов кость. В этом исследовании мы описываем используется воспроизводимый метод, который позволяет приобретение PRP для экспериментов на животных4.
После поражения сухожилий часто наблюдаются в спортсменов и физических рабочих, повышение процесс заживления и таким образом сократить время восстановления являются большой интерес5. Новые методы лечения, которые разрабатывают часто связаны с использованием факторов роста, и администрация ОТР является простой и минимально инвазивной способ доставить смесь эндогенных факторов роста4.
Несколько в пробирке или животных исследования показали, что администрация плазмы, содержащие высокий уровень тромбоцитов, выпуская биологических посредников, могут стимулировать ремонт сухожилия и связки, выпустив биологических посредников6 ,,78,9. Кроме того другие исследования показали, что PRP могут стимулировать типа I и III синтез коллагена в сухожилие клетки9,10,11. Он также предложил, что PRP может уменьшить активации матрицы металлопротеиназ (MMPs) и таким образом уменьшить деградацию матрицы. Клетки, которые участвуют в процессе воспаления могут производить MMP-9, который играет роль в ткани реконструкции (физиологические и патологические) индуцированных воспаление12.
Основываясь на этой информации, мы предположили, что однократного введения ОТР в секционного ахиллова сухожилия крысы могут улучшить процесс восстановления и механическую прочность ткани, ремонт. Это проверяется путем измерения биомеханические свойства исцеления сухожилия во время процесса восстановления и гистологические и молекулярный анализ для оценки коллагена Ремоделирование в новообразованной ткани. Целью исследования было наблюдать, если одной инъекции аллогенной PRP могут повлиять на исцеление секционного ахиллова сухожилия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тромбоциты имеют важное значение для раннего воспалительной фазы сухожилия, процесс заживления. Когда эти тромбоцитов подвергаются обязательной ткани или факторы, которые вызывают коагуляции, они будут выпускать факторы роста, которые хранятся в α гранул. Вследствие этого взаимодейс…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано стандартных де Льеж и Лежён – Lechien предоставляет Леон Frédéricq средств.
Materials
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -. C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. Sample size determination. ILAR J. 43, 207-213 (2002).
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -. F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -. F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
