Summary

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

Published: May 28, 2017
doi:

Summary

هنا، نحن تصف بروتوكول لرسم الخرائط على نطاق الجينوم من مواقع التكامل من مولوني الفئران فيروس اللوكيميا النواقل الفيروسية القائمة على فيروس في الخلايا البشرية.

Abstract

مولوني الفئران اللوكيميا (ملف) الفيروسات الفيروسية القائمة على الفيروس تتكامل في الغالب في المحسنات أسيتيلاتد والمروجين. لهذا السبب، يمكن استخدام مواقع التكامل مف كعلامات وظيفية من العناصر التنظيمية النشطة. هنا، نقدم أداة مسح الفيروسات الرجعية، والذي يسمح لتحديد الجينوم على نطاق واسع من المعززات خلية محددة والمروجين. باختصار، يتم ترانزدوسد السكان الخلية المستهدفة مع ناقلات المشتقة ملف ويتم هضم الحمض النووي الجيني مع انزيم تقييد القطع في كثير من الأحيان. بعد ربط الشظايا الجينومية مع رابط الحمض النووي متوافق، وتفاعل سلسلة البلمرة ربط بوساطة (لم-ير) يسمح التضخيم من تقاطع الجينوم الفيروس المضيف. ويستخدم تسلسل هائل من أمبليكونس لتحديد ملف التكامل التكامل الجينوم واسعة. وأخيرا، يتم تعريف مجموعات من التكامل المتكررة لتحديد المناطق التنظيمية محددة الخلية، المسؤولة عن تفعيل الخلايا من نوع برامج النسخي محددة.

<p class= "jove_content"> تسمح أداة المسح الضوئي للفيروسات الرجعية بتحديد الجينوم على نطاق واسع للمروجين والمحسنات الخاصة بالخلية في مجموعات الخلايا المستهدفة معزولة مستقبلا. ومن الجدير بالذكر أن المسح الضوئي للفيروسات الرجعية يمثل تقنية فعالة للتعرف بأثر رجعي على السكان النادرين ( مثل الخلايا الجذعية الجسدية) التي تفتقر إلى علامات قوية للعزلة المرتقبة.

Introduction

يتم تحديد هوية الخلية عن طريق التعبير عن مجموعات محددة من الجينات. دور العناصر التنظيمية سيس، مثل المروجين والمعززة، أمر بالغ الأهمية لتفعيل الخلايا من نوع برامج النسخي محددة. وتتميز هذه المناطق التنظيمية بميزات لونين محددة، مثل تعديلات هيستون غريبة، وعوامل النسخ والعوامل المشتركة الملزمة، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين، والتي استخدمت على نطاق واسع لتحديدها على نطاق الجينوم في عدة أنواع من الخلايا 1 ، 2 ، 3 . على وجه الخصوص، يستخدم على نطاق واسع الجينوم على نطاق واسع من أستيليون هيستون H3 ليسين 27 (H3K27ac) لتحديد المروجين النشطة، والمحسنات وعظم المعززات 4 ، 5 ، 6 .

مولوني الفئران فيروس سرطان الدم (مف) هو فيروس غاما ريتروفيروس الذي يستخدم على نطاق واسع للجيناتنقل في خلايا الثدييات. بعد إصابة الخلية المستهدفة، يتم إعادة نسخ جينوم الحمض النووي الريبي ريتروفيرال في جزيء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الذي يربط البروتينات الفيروسية والخلوية لتجميع مجمع ما قبل التكامل (بيك). بيك يدخل نواة ويربط لونين الخلية المضيفة. هنا، إنتغراس الفيروسية، عنصر بيك الرئيسية، يتوسط دمج الحمض النووي بروفيرال في الجينوم الخلية المضيفة. والتكامل ملف في الحمض النووي الجيني ليس عشوائيا، ولكن يحدث في العناصر النشطة التنظيمية سيس، مثل المروجين والمعززين، بطريقة محددة خلية 7 ، 8 ، 9 ، 10 . يتم التوسط هذا الملف التكامل غريبة عن طريق التفاعل المباشر بين إنتغراس مف والبرومودومين الخلوية والنطاق إكستراترمينال (بيت) البروتينات 11 ، 12 ، 13 . البروتينات بيت (BRD2، BRD3، وBRD4) بمثابة جسر بين الكروماتين المضيف و بيك الموافقة المسبقة عن علم: من خلال برومودومينز أنها تعترف للغاية أسيتيلاتد المناطق التنظيمية رابطة الدول المستقلة، في حين أن المجال إكستراترمينال يتفاعل مع مف إنتغراس 11 ، 12 ، 13 .

هنا، نحن تصف المسح الضوئي للفيروسات الرجعية، أداة جديدة لتعيين المناطق النشط- سيس التنظيمية على أساس خصائص التكامل من مف. باختصار، يتم ترانسدوسد الخلايا مع ناقلات فيروس النسخ الاحتياطي المستمدة مف لفب التعبير عن تعزيز البروتين الأخضر الفلورسنت (إغف) مراسل الجينات. بعد استخراج الحمض النووي الجيني، يتم تضخيم تقاطعات بين 3 'تكرار محطة طويلة (لتر) من ناقلات مف والحمض النووي الجيني من قبل ربط بوساطة ير (لم-ير) وتسلسل بشكل واسع. يتم تعيين مواقع التكامل ملف إلى الجينوم البشري والمناطق الجينومية المستهدفة للغاية من قبل ملف تعرف بأنها مجموعات من مواقع التكامل ملف.

المسح الضوئي للفيروسات الرجعيةتم استخدام نينغ لتحديد العناصر التنظيمية النشطة الخلية محددة في العديد من الخلايا الأولية الإنسان 14 ، 15 . مف التي تم تحديدها بشكل مشترك مع المروجين والمعززين المعرفة إبيجينيتيكالي، ومعظمها تأوي علامات هيستون النشطة، مثل H3K27ac، وكانت محددة الخلية. المسح الضوئي للفيروسات الرجعية يسمح لتحديد الجينوم على نطاق واسع من العناصر التنظيمية الحمض النووي في مستقبلي تنقيته السكان الخلية 7 ، 14 ، وكذلك في السكان خلية محددة بأثر رجعي، مثل الخلايا الجذعية الخلايا الكيراتينية، التي تفتقر إلى علامات فعالة لعزلة المحتملين 15 .

Protocol

1. ملف تناسل الخلايا البشرية عزل الخلايا المستهدفة و ترانزدوس لهم مع ناقلات فيروس الورم الرجعي المستمدة مف التي تؤوي الجين مراسل إغف و بسيودوتيبد مع الحويصلي فيروس الفم G (فسف-G) أو بروتين سكري مغلف أمفوتروبيك <sup clas…

Representative Results

سير عمل إجراء المسح الضوئي للفيروسات الرجعية يتم تخطي تدفق العمل من إجراء المسح الضوئي فيروسات في الشكل 1 . يتم تنقية السكان الخلية المستهدفة و ترانسدوسد مع ناقلات فيروس النسخ ال…

Discussion

هنا، وصفنا بروتوكول لرسم الخرائط على نطاق الجينوم على مواقع التكامل من مف، وهو فيروس ريتروفيروس الذي يستهدف مناطق الكروماتين، علامة إبيجينيتيكالي كما المروجين النشطة والمحسنات. الخطوات الحاسمة و / أو القيود على البروتوكول ما يلي: (ط) تنبيغ مف السكان الخلية المستهدف?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل بمنح مقدمة من مجلس البحوث الأوروبي (إرك-2010-أدغ، غ-سكين)، ووزارة التعليم الإيطالية والجامعات والبحوث (فيرب-فوتورو في ريسركا 2010-RBFR10OS4G، فيرب-فوتورو في ريسركا 2012-RBFR126B8I_003 ، ومشروع إبيجن إبيجينوميكس الرائد)، ووزارة الصحة الإيطالية (باحثون شباب دعوة 2011 غر-2011-02352026) ومؤسسة معهد إيماجين (باريس، فرنسا).

Materials

PBS, pH 7.4 ThermoScientific 10010031 or equivalent
Fetal Bovine Serum ThermoScientific 16000044 or equivalent
0.2 ml tubes general lab supplier
1.5 ml tubes general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit  QIAGEN 51306 or equivalent
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer New England BioLabs M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I Roche-Sigma-Aldrich 11464825001
SuRE/Cut Buffer M Roche-Sigma-Aldrich 11417983001
PstI  Roche-Sigma-Aldrich 10798991001
SuRE/Cut Buffer H Roche-Sigma-Aldrich 11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity  Invitrogen 11304011
10mM dNTP Mix Invitrogen 18427013 or equivalent
PCR grade water general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
linker primer general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer general lab supplier 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina general lab supplier 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina general lab supplier 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) Invitrogen K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 28704
Agarose Sigma-Aldrich A9539 or equivalent
Ethidium bromide  Sigma-Aldrich E1510 or equivalent
100 bp DNA ladder Invitrogen 15628019 or equivalent
6X Loading Buffer ThermoScientific R0611 or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer ThermoScientific ND-2000
Nextera XT Index kit Illumina FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix  KAPA Biosystems KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes Invitrogen 12321D or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit Beckman Coulter Genomics A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system Agilent Technologies G2964AA or equivalent
D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5582 or equivalent
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583 or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) KAPA Biosystems KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer) Illumina  Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) Illumina MS-102-3001
MiSeq System Illumina SY-410-1003
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001

References

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

Play Video

Cite This Article
Romano, O., Cifola, I., Poletti, V., Severgnini, M., Peano, C., De Bellis, G., Mavilio, F., Miccio, A. Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions. J. Vis. Exp. (123), e55919, doi:10.3791/55919 (2017).

View Video