本文介绍一种在人类细胞中对基于莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录病毒载体整合位点进行全基因组定位的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
基于莫洛尼鼠白血病（MLV）病毒的逆转录病毒载体主要整合到乙酰化的增强子和启动子区域。因此，mLV整合位点可作为活性调控元件的功能性标记。本文介绍了一种逆转录病毒扫描工具，可用于全基因组范围内鉴定细胞特异性的增强子和启动子。简言之，用mLV衍生的载体转导目标细胞群体，随后用一种高频切割的限制性内切酶消化基因组DNA。在将基因组片段与相容的DNA接头连接后，通过接头介导的聚合酶链式反应（LM-PCR）扩增病毒与宿主基因组的连接区域。对扩增产物进行高通量测序，以确定mLV全基因组范围的整合图谱。最后，通过定义反复出现的整合簇，识别负责激活细胞类型特异性转录程序的细胞特异性调控区域。
逆转录病毒扫描技术可实现对前瞻性分离的目标细胞群体中细胞特异性启动子和增强子的全基因组范围鉴定。值得注意的是，逆转录病毒扫描是一种关键的技术手段，可用于回溯性鉴定那些缺乏可靠标记物、难以通过前瞻性方法分离的稀有细胞群体（例如 体细胞干细胞）。
引言
细胞身份由特定基因集合的表达决定。顺式调控元件（如启动子和增强子）在激活细胞类型特异性转录程序中起着关键作用。这些调控区域具有特定的染色质特征，例如特殊的组蛋白修饰、转录因子及其共因子的结合以及染色质可及性，这些特征已被广泛用于在多种细胞类型中全基因组水平地鉴定调控元件1,2,3。特别是，组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）的全基因组分布常被用于界定活性启动子、增强子以及超级增强子4,5,6。
莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）是一种γ-逆转录病毒，广泛用于哺乳动物细胞的基因转移。感染靶细胞后，该逆转录病毒的RNA基因组被逆转录为双链DNA分子，并结合病毒和细胞蛋白，组装成前整合复合物（PIC）。PIC进入细胞核并与宿主细胞染色质结合。在此过程中，作为PIC关键组分的病毒整合酶介导前病毒DNA插入宿主细胞基因组。mLV在基因组DNA中的整合并非随机，而是以细胞类型特异性的方式，偏好发生在启动子和增强子等活跃的顺式调控元件区域7,
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方案
1. 人类细胞的MLV转导
- 分离目标细胞，并使用携带 eGFP 报告基因且伪型化为水疱性口炎病毒G蛋白（VSV-G）或兼嗜性包膜糖蛋白的mLV来源逆转录病毒载体进行转导16.
- 将未转导的细胞作为后续分析的阴性对照。由于基于mLV的逆转录病毒载体可高效转导正在分裂的细胞，因此需将靶细胞群体培养在能够刺激细胞分裂的条件下。每种研究细胞类型的转导条件均需单独优化。有关人造血祖细胞、T细胞和表皮细胞的细胞生长与转导条件详见参考文献7、14、15和17。
- 转导48小时后，将100,000个细胞重悬于 300 μL 含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS）中，通过流式细胞术分析（488 nm激发激光）检测eGFP表达。以未转导细胞作为阴性对照。为获得最佳整合位点回收效果，分选GFP阳性细胞+ 通过荧光激活细胞分选（FACS）对细胞进行分选。
- 收集0.5至500万个细胞用于基因组DNA制备。延长培养时间（>7 天）更有利于稀释未整合的前病毒，在分析长期子代时尤为必要 真正有效的 干细胞（参见 讨论部分 和参考文献15). 细胞沉淀可进行速冻，并于 -80 °C 直至使用。
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结果
逆转录病毒扫描程序的工作流程
逆转录病毒扫描流程如图1所示。首先纯化目标细胞群体，并用表达eGFP报告基因的鼠白血病病毒（mLV）衍生的逆转录病毒载体进行转导。该转基因两侧为两个相同的长末端重复序列（5'和3' LTR），以确保病毒基因组的合成、逆转录及整合到宿主DNA中。通过FACS分析eGFP表达水平来评估转导效率。选择mLV转导细胞比例较高（>30%）的细胞群体进行扩增，随后裂解细胞以提取包含整合型mLV病毒序列的基因组DNA。基因组DNA经酶切后，连接兼容性接头，并通过LM-PCR扩增病毒3' LTR与宿主基因组之间的连接区域。随后，利用Roche或Illumina测序平台对病毒与宿主基因组的连接区域进行大规模测序。最后，将mLV整合位点比对至人类基因组，以确定反复插入位点的基因组簇。
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讨论
本文描述了一种用于全基因组范围内定位小鼠白血病病毒（mLV）整合位点的实验方案，mLV 是一种靶向染色质区域的逆转录病毒，倾向于整合至表观遗传标记为活性启动子和增强子的区域。该方案的关键步骤和/或局限性包括：（i）mLV 对靶细胞群体的转导；（ii）通过连接介导的PCR（LM-PCR）扩增病毒-宿主连接区域；（iii）高效回收大量整合位点。基于mLV的逆转录病毒载体可高效转导分裂期细胞。然而，其对非分裂细胞（例如有丝分裂后的神经元细胞）转导效率较低，是本技术的一个潜在局限。不过，可通过根据报告基因（例如 eGFP）的表达情况对转导细胞进行分选来克服这一问题。LM-PCR 产生的扩增子长度相对较短（150 至 500 bp），这是必要的，以构建适用于当前高通量测序策略的文库，并实现对 mLV 整合位点的全基因组范围的全面分析。例如，若 LM-PCR 扩增出长度 >500 bp 的产物，可能源于基因组 DNA 的不完全消化，或 Tru9I 酶切后基因组片段的分子内连接，这一点已通过 LM-PCR 扩增子的鸟枪法克隆分析得到验证（数据未显示）。在前一种情况下，可通过进一步优化基因组 DNA 的消化条件来解决；而在后一.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了欧洲研究理事会（ERC-2010-AdG，GT-SKIN）、意大利教育、大学和研究部（FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G、FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003、EPIGEN 表观基因组旗舰项目）、意大利卫生部（2011年青年研究人员项目 GR-2011-02352026）以及巴黎伊马金研究所基金会（法国巴黎）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBS，pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | 或同类产品 |
| 胎牛血清 | ThermoScientific | 16000044 | 或同类产品 |
| 0.2 ml 离心管 | 通用实验室供应商 | ||
| 1.5 ml 离心管 | 通用实验室供应商 | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | 或同类产品 |
| T4 DNA 连接酶 | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA 连接酶反应缓冲液 | New England BioLabs | M0202T | |
| 连接子正链寡核苷酸 | 通用实验室供应商 | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ （纯化级别：SDS-PAGE） | |
| 连接子负链寡核苷酸 | 通用实验室供应商 | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’（纯化级别：SDS-PAGE） | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA 高保真聚合酶 | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP 混合液 | Invitrogen | 18427013 | 或同类产品 |
| PCR 级水 | 通用实验室供应商 | ||
| 96 孔热循环仪（带加热盖） | 通用实验室供应商 | ||
| 连接子引物 | 通用实验室供应商 | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’（纯化级别：PCR 级） | |
| MLV-3’ LTR 引物 | 通用实验室供应商 | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’（纯化级别：PCR 级） | |
| 连接子嵌套引物 454 | 通用实验室供应商 | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC]（纯化级别：SDS-PAGE） | |
| MLV-3’ LTR 嵌套引物 454 | 通用实验室供应商 | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC]（纯化级别：SDS-PAGE） | |
| 连接子嵌套引物 Illumina | 通用实验室供应商 | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC]（纯化级别：SDS-PAGE） | |
| MLV-3’ LTR 嵌套引物 Illumina | 通用实验室供应商 | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC]（纯化级别：SDS-PAGE） | |
| 乙酸钠溶液（3 M），pH 5.2 | 通用实验室供应商 | ||
| 分子生物学级无水乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | 或同类产品 |
| Topo TA 克隆试剂盒（含 pCR2.1-TOPO 载体） | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | QIAGEN | 28704 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | 或同类产品 |
| 溴化乙锭 | Sigma-Aldrich | E1510 | 或同类产品 |
| 100 bp DNA Marker | Invitrogen | 15628019 | 或同类产品 |
| 6x 上样缓冲液 | ThermoScientific | R0611 | 或同类产品 |
| NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index 试剂盒 | Illumina | FC-131-1001 或 FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| 适用于 2 ml 管的 Dynal 磁力架 | Invitrogen | 12321D | 或同类产品 |
| Agencourt AMPure XP 60 ml 试剂盒 | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM，pH 8.5 | 通用实验室供应商 | ||
| Agilent 2200 TapeStation 系统 | Agilent Technologies | G2964AA | 或同类产品 |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | 或同类产品 |
| D1000 试剂 | Agilent Technologies | 5067-5583 | 或同类产品 |
| KAPA 文库定量试剂盒（适用于 Illumina 平台，ABI Prism） | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems | 4329003 | |
| 1.0 N NaOH，分子生物学级 | 通用实验室供应商 | ||
| HT1（杂交缓冲液） | Illumina | 包含于 MiSeq 试剂盒中 | |
| MiSeq 试剂盒 v3（150 个循环） | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq 系统 | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
参考文献
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet.
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重印与许可
