Summary

Eine Filtrations-basierte Methode zur Herstellung von hochwertigen Nuklei aus vernetzten Skelettmuskeln für Chromatin-Immunpräzipitation

Published: July 06, 2017
doi:

Summary

Wir präsentieren ein Filtrations-basiertes Protokoll, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Mäuseskelettmuskeln zu isolieren, wobei wir die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation entfernt haben, wodurch es leicht anwendbar ist. Wir zeigen, dass das aus den Kernen hergestellte Chromatin für die Chromatin-Immunpräzipitation und wahrscheinlich Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungsstudien geeignet ist.

Abstract

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinbindung an Chromatin-DNA. Faserreicher Skelettmuskel war jedoch eine Herausforderung für ChIP aufgrund technischer Schwierigkeiten bei der Isolierung von hochwertigen Kernen mit minimaler Kontamination von Myofibrillen. Bisherige Protokolle haben versucht, Kerne vor der Vernetzung zu reinigen, was das Risiko einer veränderten DNA-Protein-Wechselwirkung während des verlängerten Keimpräparationsverfahrens verursacht. In dem aktuellen Protokoll haben wir zuerst das Skelettmuskelgewebe, das von Mäusen gesammelt wurde, vernetzt und die Gewebe wurden gehackt und beschallt. Da wir festgestellt haben, dass die Ultrazentrifugation nicht in der Lage war, Kerne von Myofibrillen unter Verwendung von vernetzten Muskelgeweben zu trennen, entwickelten wir ein sequentielles Filtrationsverfahren, um qualitativ hochwertige Kerne ohne signifikante Myofibrillenverunreinigung zu erhalten. Anschließend wurden Chromatin unter Verwendung eines Ultraschallgerätes hergestellt und ChIP-Assays mit anti-BMAL1-Antikörper zeigten eine robuste zirkadiane BindungMuster von BMAL1 zu Zielgen-Promotoren. Dieses Filtrationsprotokoll stellt eine leicht anwendbare Methode dar, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Skelettmuskelgeweben zu isolieren, was eine konsistente Probenverarbeitung für zirkadiane und andere zeitempfindliche Studien ermöglicht. In Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) kann unsere Methode für verschiedene mechanistische und genomische Studien eingesetzt werden, die sich auf die Skelettmuskelfunktion konzentrieren.

Introduction

Skelettmuskel spielt eine wichtige Rolle in Physiologie und Verhalten. Die mehrkernige Muskelfaser besteht aus Myofibrillen, in denen Aktin und Myosin funktionale Einheiten bilden, die Sarkomere genannt werden, um kontraktile Kraft zu erzeugen. Skelettmuskel ist auch das größte Stoffwechselorgan im Körper, das für> 80% postprandiale Glukoseaufnahme und regulierende Insulinreaktion und metabolische Homöostase 1 , 2 verantwortlich ist . Die Muskelphysiologie und der Stoffwechsel werden durch die zirkadiane Uhr, einen intrinsischen biologischen Timer 3 , 4 , 5 , 6, genau reguliert. Zum Beispiel führte die Skelettmuskelspezifische Deletion von Bmal1 , einer der Kern-zirkadianen Taktkomponenten , zu einer Insulinresistenz und einer verminderten Glukoseaufnahme im Skelettmuskel, und die Tiere wurden gefunden, um Typ-2-Diabetes 7 zu entwickeln . ichNeben der Skelettmuskulatur wird auch zunehmend ein endokrines Organ 8 geschätzt, das Myokine sekretiert, um den systemischen Stoffwechsel und die Physiologie zu regulieren. Mechanistische Studien sind erforderlich, um diese regulatorischen Funktionen im Skelettmuskel vollständig zu verstehen.

ChIP ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Abgrenzung der Promotorrekrutierung von DNA-bindenden Proteinen. ChIP wurde ursprünglich entwickelt, um die Nukleosomenorganisation auf Chromatin-DNA 9 , 10 zu identifizieren. Es wurde bisher eine Vielzahl von Verfahren zur Vernetzung von Proteinen und Chromatin-DNA unter Verwendung von Formaldehyd, Dimethylsulfat oder Ultraviolettbestrahlung (UV) 11 , 12 beschrieben . Die Formaldehyd-Vernetzung ist die am häufigsten verwendete, konservierende Chromatinstruktur und DNA-Protein-Wechselwirkungen 9 , 13 , 14 . Vernetztes ChromatIn wird durch Beschallung zerkleinert und mit Antikörper gegen das jeweilige DNA-bindende Protein von Interesse 15 , 16 immunpräzipitiert. In den letzten Jahren wurde die ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq), eine Methode, die ChIP mit NGS kombiniert, entwickelt, um die genomweite Transkriptionsfaktorbindung 17 zu untersuchen und in einigen Fällen die dynamischen Veränderungen über einen Zeitverlauf 18 , 19 , 20 zu überwachen . Zum Beispiel haben zirkadiane ChIP-seq-Studien eine hochorchestrierte Sequenz der genomischen Bindung von zirkadianen Taktkomponenten und Histonmarkern, die eine zeitlich präzise Genexpression während des gesamten 24h-zirkadischen Zyklus 18 antreibt.

Die meisten verfügbaren ChIP-Protokolle sind für Weichgewebe ( zB Leber, Gehirn, etc. ) konzipiert, und nur sehr wenige wurden für harte Gewebe einschließlich Skele veröffentlichtTal muskel Es ist technisch anspruchsvoll, den faserreichen Skelettmuskel zu homogenisieren und die hochwertigen Kerne 21 zu isolieren, insbesondere für ChIP-Experimente, die eine Vernetzung erfordern. In einer neueren Muskel-ChIP-Studie 22 wurden Satelliten-Zellen von Myofasern getrennt, und die Kerne wurden aus beiden Zelltypen durch ein verlängertes Verfahren mit Gewebeverdauung hergestellt. Der gesamte Prozeß dauerte etwa drei Stunden, bis die Formaldehyd-Vernetzung an isolierten Kernen durchgeführt wurde. Während dieses Verfahren eine vernetzte Muskelfaser vermeidet, die das Muskelgewebe für eine effiziente Homogenisierung noch widerstandsfähiger macht und in der Lage war, qualitativ hochwertige Kerne herzustellen, entsteht die signifikante Zeitverzögerung von der Gewebsansammlung zur Keimvernetzung das Risiko einer veränderten DNA -protein-interaktion Im Gegensatz dazu führten die meisten Studien eine Vernetzung unmittelbar nach der experimentellen Behandlung oder Gewebesammlung durch, um das Echtzeit-DNA-Protei zu erhaltenN Bindung 12 Ein zweiter Nachteil der Kerneisolation vor der Vernetzung besteht darin, dass sie zeitempfindliche Anwendungen wie zirkadiane Probensammlungen ausschließt, die typischerweise in Intervallen von 3 – 4 h auftreten. Ohne Vernetzung der Kerne muss die Isolierung unmittelbar nach der Sezierung erfolgen, während vernetzte Proben nach Beendigung des gesamten Zeitverlaufs zusammen verarbeitet werden können, so dass eine größere experimentelle Konsistenz gewährleistet ist.

Andere Protokolle für die Kernenisolation aus dem unvernetzten Skelettmuskel wurden ebenfalls berichtet. Zwei Studien beschreiben die Verwendung von Gradienten-Ultrazentrifugation, um Kerne von verbleibenden Myofibrillen und Zelltrümmern 23 , 24 zu trennen. Während die Saccharose- oder Kolloidgradienten-Ultrazentrifugation mit unvernetzten Muskelgeweben wirksam ist, zeigten unsere Experimente, dass nach der Vernetzung die Gradienten-Ultrazentrifugation die Kerne nicht von der Zelle d trennteEbris auf dem gradienten

Wir haben daher ein Verfahren entwickelt, um qualitativ hochwertige Kerne unter Verwendung von vernetzten Maus-Skelettmuskelgeweben zu isolieren. Statt der Gradienten-Ultrazentrifugation haben wir eine serielle Filtrationsmethode entwickelt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Chromatinproben erfolgreich für ChIP-Studien angewendet, die ein zirkadianes Muster der BMAL1-Proteinbindung an Ziel-Promotoren zeigten. Unsere Methode kann breit auf verschiedene mechanistische Studien von Muskelgeweben anwendbar sein.

Protocol

Die Tierpflege wurde unter den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt und die Verfahren wurden nach einem Tierprotokoll durchgeführt, das von der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt wurde. 1. Kernisolierung aus vernetzten Skelettmuskeln Wiegen und Hackfleisch-Skelettmuskel, isoliert von etwa 20 Wochen alten C57BL / 6 männlichen Mäusen, in eiskalter Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS), wie im Detail zuv…

Representative Results

Hier haben wir die Formaldehyd-Vernetzung unmittelbar nach der Gewebesammlung durchgeführt, um die DNA-Protein-Wechselwirkung in Echtzeit zu bewahren. Jedoch fanden wir, dass Saccharose oder kolloidaler Gradient, der üblicherweise für die Kerneisolation 23 , 24 verwendet wurde , bei der Trennung von Kernen von Myofibrillen (Daten nicht gezeigt) wirksam war. Der Grund mag sein, dass die Vernetzung eine ähnliche Schwerkraft fü…

Discussion

Hier beschreiben wir eine robuste Methode, bei der vernetzte Skelettmuskelgewebe verwendet wurden, um qualitativ hochwertige Kerne zu isolieren. Eine sequenzielle Filtration wurde durchgeführt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen, und die akustische Ultraschall-Energie aus dem schalenförmigen Wandler scherte das Chromatin für die ChIP-Analyse. Die Ergebnisse zeigten eine zirkadiane zeitspezifische Bindung von BMAL1 an Zielpromotoren.

ChIP kann verwendet werden, um Echtzeit-Prot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Karyn Esser, Nobuya Koike und Noheon Park für hilfsbereite Beratung. Diese Arbeit wurde zum Teil von NIH / NIGMS (R01GM114424) an S.-HY und der Robert A. Welch Foundation (AU-1731) und NIH / NIA (R01AG045828) an ZC unterstützt

Materials

Materials
Formaldehyde solution Sigma Aldrich F8775 
Glycine Fisher Scientific BP381-5
Trypan Blue solution (0.4%) Fisher Scientific 15250061
RNase A Sigma Aldrich 10109142001
Protease K Sigma Aldrich 3115887001
Chicken Anti-BMAL1 antibody Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. 
Chicken IgY Precipitating Resin GenScript L00405
Equipment
KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer Fisher Scientific 08-451-178
15mL Dounce tissue grinder Whearton 357544
Falcon Cell Strainers 100µm Fisher Scientific 08-771-19
Falcon Cell Strainers 70µm Fisher Scientific 08-771-1
Falcon Cell Strainers 40µm Fisher Scientific 08-771-2
pluriStrainer 30 µm PluriSelect 43-50030-03
pluriStrainer 20 µm PluriSelect 43-50020-03
pluriStrainer 10 µm PluriSelect 43-50010-03
Covaris S2 Focused-ultrasonicator Covaris Model S2
Labquake  Thermo Scientific C415110
CCD Microscope Camera  Leica Microsystems DFC3000 G
Reagent Kit
DNA extraction kit Thermo Scientific K0691
Buffers
All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich

References

  1. Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
  2. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
  3. Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
  4. Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
  5. Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
  6. Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
  7. Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
  8. Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
  9. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  10. Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
  11. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  12. Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
  13. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
  14. Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
  15. Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
  16. Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
  17. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  18. Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
  19. Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
  20. Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
  21. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
  22. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
  23. Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
  24. Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
  25. Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
  26. Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
  27. Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
  28. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  29. Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
  30. Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
  31. Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
  32. Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).

Play Video

Cite This Article
Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (125), e56013, doi:10.3791/56013 (2017).

View Video