Un metodo basato sulla filtrazione per preparare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico incrociato per l'immunoprecipitazione cromatina
Summary
Presentiamo un protocollo basato sulla filtrazione per isolare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico del mouse a croce, in cui abbiamo rimosso la necessità di ultracentrifugazione, rendendola facilmente applicabile. Mostriamo che la cromatina preparata dai nuclei è adatta per l'immunoprecipitazione di cromatina e probabilmente gli studi di sequenza di immunoprecipitazione cromatina.
Abstract
L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è un metodo potente per determinare la legame delle proteine al DNA cromatina. Il muscolo scheletrico ricco di fibre, tuttavia, è stato una sfida per ChIP a causa di difficoltà tecniche in isolamento di nuclei di alta qualità con minima contaminazione dei miofibri. I protocolli precedenti hanno tentato di purificare i nuclei prima di incrociare, il che comporta il rischio di alterazione dell'interazione tra proteine del DNA durante il prolungato processo di preparazione del nucleo. Nel protocollo attuale, abbiamo prima incrociato il tessuto muscolare scheletrico raccolto dai topi, ei tessuti vennero macinati e sottoposti a sonicazione. Dal momento che abbiamo scoperto che l'ultracentrifugazione non era in grado di separare i nuclei dai miofibri usando tessuti muscolari reticolati, abbiamo elaborato una procedura di filtrazione sequenziale per ottenere nuclei di alta qualità privi di contaminazione myofibra significativa. Successivamente abbiamo preparato la cromatina usando un ultrasonicator, e i test di ChIP con anti-BMAL1 anticorpo hanno rivelato robusto legame circadianoPattern di BMAL1 a destinare i promotori del gene. Questo protocollo di filtrazione costituisce un metodo facilmente applicabile per isolare nuclei di alta qualità dal tessuto muscolare scheletrico reticolato, consentendo un'elaborazione costante del campione per studi circadiani e altri sensibili ai tempi. In combinazione con sequenziamento di nuova generazione (NGS), il nostro metodo può essere impiegato per vari studi meccanici e genomici incentrati sulla funzione muscolare scheletrica.
Introduction
Il muscolo scheletrico gioca un ruolo importante nella fisiologia e nel comportamento. La fibra muscolare multi-nucleata è costituita da miofibri in cui l'actina e la myosina formano unità funzionali chiamate sarcomeri per generare forza contrattile. Il muscolo scheletrico è anche il più grande organo metabolico del corpo, che rappresenta l'assunzione postprandiale del glucosio> 80% e regola la risposta dell'insulina e l'omeostasi metabolica 1 , 2 . La fisiologia muscolare e il metabolismo sono strettamente regolamentati dall'orologio circadian, un timer biologico intrinseco 3 , 4 , 5 , 6 . Ad esempio, la delezione muscolare-scheletrica di Bmal1 , uno dei principali componenti orologi circadiani, ha determinato una resistenza all'insulina e una riduzione della somministrazione di glucosio nel muscolo scheletrico e gli animali sono stati individuati per sviluppare il diabete di tipo 2 7 . ioInoltre, il muscolo scheletrico è sempre più apprezzato come un organo endocrino 8 , secreto le miokine per regolare il metabolismo sistemico e la fisiologia. Studi meccanici sono necessari per comprendere appieno queste funzioni regolatrici nel muscolo scheletrico.
ChIP è un approccio potente per delineare il reclutamento del promotore delle proteine legate al DNA. ChIP è stato inizialmente sviluppato per identificare l'organizzazione dei nucleosomi nel DNA cromatina 9 , 10 . Una varietà di metodi sono da allora riportati alle proteine a croce e al cromatin DNA utilizzando formaldeide, dimetilsolfato o irradiazione ultravioletta (UV) 11 , 12 . Il cross-linking di formaldeide è la struttura più comunemente utilizzata per la conservazione della cromatina e le interazioni tra DNA e proteine 9 , 13 , 14 . Cromatico reticolatoIn è triturata dalla sonicazione e immunoprecipitato con anticorpo contro la particolare proteina legante del DNA di interesse 15 , 16 . Negli ultimi anni, il ChIP-sequenza (ChIP-seq), un metodo che unisce ChIP con NGS, è stato sviluppato per interrogare il legame di genitia di fattore di trascrizione 17 e in alcuni casi per monitorare le variazioni dinamiche su un corso di tempo 18 , 19 , 20 . Ad esempio, gli studi circadiani ChIP-seq hanno rivelato una sequenza altamente orchestrata di legame genomico dei componenti dell'orologio circadiano e dei marcatori istoni, che conduce un'espressione genica precisa in tutto il ciclo circadian 24 h.
La maggior parte dei protocolli ChIP disponibili sono progettati per i tessuti molli ( ad es. Fegato, cervello, ecc. ) E pochissimi sono stati pubblicati per tessuti duri, tra cui scafoTal muscolo. È tecnicamente impegnativo per omogeneizzare i muscoli scheletrici ricchi di fibre e isolare nuclei di alta qualità 21 , specialmente per gli esperimenti ChIP che richiedono un collegamento incrociato. In un recente studio muscolo ChIP 22 , le cellule satellitari sono state separate da miofibere e nuclei sono stati preparati da entrambi i tipi di cellule attraverso una prolungata procedura che coinvolge la digestione tissutale. L'intero processo ha richiesto circa tre ore per completare prima che la fusione di formaldeide sia stata eseguita su nuclei isolati. Mentre questa procedura evitava la creazione di fibre muscolari incrociate, rendendo il tessuto muscolare ancora più refrattario per un'efficace omogeneizzazione ed è stato in grado di produrre nuclei di alta qualità, il significativo tempo trascorso dalla raccolta dei tessuti ai reticolazione dei nuclei comporta il rischio di alterato DNA -interazione tra proteine. Al contrario, la maggior parte degli studi ha effettuato la reticolazione immediatamente dopo il trattamento sperimentale o la raccolta dei tessuti al fine di preservare le proteine del DNA in tempo realeN vincolante 12 . Un secondo inconveniente dell'isolamento del nucleo prima della connessione incrociata è che preclude applicazioni sensibili al tempo come ad esempio la raccolta di campioni circadiani che si presenta tipicamente a intervalli di 3 – 4 ore. Senza incrociare i nuclei, l'isolamento deve proseguire immediatamente dopo la dissezione, mentre campioni reticolati possono essere elaborati insieme dopo l'intero ciclo di tempo completato, garantendo così una maggiore consistenza sperimentale.
Sono stati inoltre riportati altri protocolli per l'isolamento del nucleo da muscoli scheletrici non rettangolari. Due studi hanno descritto l'utilizzo di ultracentrifugazione gradiente a nuclei separati da residui di miopi e detriti cellulari 23 , 24 . Mentre il saccarosio o l'ultracentrifugazione a gradiente colloidale sono efficaci con i tessuti muscolari non rettilineati, i nostri esperimenti hanno rivelato che dopo il reticolazione, l'ultracentrifugazione di gradiente non è riuscita a separare i nuclei dalla cella dEbris sul gradiente.
Abbiamo quindi sviluppato una procedura per isolare nuclei di alta qualità usando tessuti muscolari scheletriche a croce. Piuttosto che l'ultracentrifugazione gradiente, abbiamo elaborato un metodo di filtrazione seriale per separare efficacemente i nuclei dai detriti. Dopo l'ultrasonografia, i campioni di cromatina sono stati applicati con successo per gli studi di ChIP che hanno mostrato un pattern circadiano di proteina BMAL1 legato ai promotori di bersaglio. Il nostro metodo può essere generalmente applicabile a vari studi meccanici dei tessuti muscolari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un metodo robusto dove i tessuti muscolari scheletrici reticolati sono stati utilizzati per isolare nuclei di alta qualità. La filtrazione sequenziale è stata effettuata per separare efficacemente i nuclei dai detriti e l'energia acustica ultrasonica dal trasduttore a forma di piatto ha tagliato la cromatina per l'analisi ChIP. I risultati hanno mostrato la correlazione temporale circadiana del BMAL1 ai promotori target.
ChIP può essere impiegato per catturare l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Karyn Esser, Nobuya Koike e Noheon Park per consigli utili. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH / NIGMS (R01GM114424) a S.-HY e dalla Fondazione Robert A. Welch (AU-1731) e NIH / NIA (R01AG045828) a ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
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