Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed
Summary
We presenteren een in vitro model waarmee de studie en analyse van coagulatie in hele, niet-vertonen bloed. Antistolling in het systeem is afhankelijk van de natuurlijke anticoagulation effect van gezonde endotheliale cellen en endothelial cel activatie zal resulteren in de bloedstolling.
Abstract
In vivo, endotheliale cellen zijn cruciaal voor de natuurlijke antistolling van circulerende bloed. Bijgevolg leidt endothelial cel activatie tot bloedstolling. Dit verschijnsel is waargenomen in veel klinische situaties, zoals orgaantransplantatie in aanwezigheid van pre-gevormde antistoffen anti-donor, met inbegrip van xenotransplantatie, evenals in ischemie/reperfusie letsel. Teneinde dierproeven volgens 3R normen (vermindering, vervanging en verfijning), in vitro model voor het bestuderen van het effect van endothelial cel zou activering op de bloedstolling zeer wenselijk zijn. Gemeenschappelijke flatbed systemen van endothelial celcultuur bieden echter een oppervlak-te-volume verhouding van 1-5 cm,2 van endotheel per mL bloed, dat niet voldoende voor natuurlijke, endotheel-gemedieerde antistolling is. Kweken van endotheliale cellen op microcarrier kralen kan verhogen de oppervlak-te-volume verhouding tot 40-160 cm2/mL. Deze verhoogde ratio is voldoende om ervoor te zorgen de “natuurlijke” antistolling volbloed, zodat het gebruik van anticoagulantia kan worden vermeden. Hier is een in vitro microcarrier gebaseerde systeem beschreven te bestuderen van de gevolgen van genetische modificatie van varkens endotheliale cellen voor stolling van hele, niet-vertonen menselijk bloed. In de beschreven assay, primaire varkens aorta endotheliale cellen, ofwel wild-type (WT) of transgene voor menselijke CD46 en thrombomodulin, werden geteeld op microcarrier kralen en vervolgens blootgesteld aan vers getrokken niet-vertonen menselijk bloed. Dit model zorgt voor de meting en kwantificering van cytokine release evenals activering markers van aanvulling en coagulatie in het bloedplasma. Daarnaast werden beeldvorming van geactiveerde endothelial cel en de afzetting van immunoglobulinen, aanvulling- en stolling eiwitten op de endothelialized parels uitgevoerd door confocale microscopie. Deze test kan ook worden gebruikt voor het testen van geneesmiddelen die worden verondersteld om te voorkomen dat endothelial cel activatie en dus coagulatie. Op de top van zijn potentieel om het aantal proefdieren voor dergelijke onderzoeken, is de beschreven test gemakkelijk uit te voeren en consequent reproduceerbaar.
Introduction
De vasculaire endotheel bestaat uit een monolayer van endotheliale cellen (EG) die lijn de lumen van bloedvaten. In een fysiologische toestand, rustige EG zijn verantwoordelijk voor het onderhoud van een antistollingsmiddel en anti-inflammatoire milieu. 1 dit is bemiddeld door de uitdrukking van antistollingsmiddel en anti-inflammatoire eiwitten op het oppervlak van de EG. Bijvoorbeeld, EG activering veroorzaakt door ischemie/reperfusie letsel of vasculaire afwijzing van (xeno-) getransplanteerde organen resultaten in een verandering van het endotheel oppervlak van een antistollingsmiddel en anti-inflammatoire staat naar een Pro-coagulant en pro-inflammatoire staat. 1
Om te bestuderen van de boeiende en complexe interactie tussen het endotheel en bloedstolling factoren, in vitro modellen die als nabootsen dicht mogelijk zijn de situatie in vivo zeer wenselijk. Een gemeenschappelijke beperking die conventionele in vitro coagulatie assays kenmerkt is het gebruik van vertonen bloed waardoor de analyse van stolling-gemedieerde effecten moeizame en zelfs recalcification citrated volbloed niet reproduceren resultaten kunnen worden verkregen met niet-vertonen van vers bloed. 2 bovendien, in traditionele flat-bed cel cultuur systemen is het onmogelijk om te exploiteren de anticoagulatie-eigenschappen van het endotheel als een voldoende endothelial celoppervlak per bloed volume kan niet worden bereikt. De hier gepresenteerde model overwint deze beperkingen door het kweken van de EG op het oppervlak van de sferische microcarrier kralen, zodat een EG oppervlak-te-bloed ratio van > 16 cm2/mL kan worden bereikt, die is vergelijkbaar met de situatie in kleine arteriolen of aderen, en die werd beschreven als toereikend zijn voor “natuurlijke” antistolling van het bloed door het oppervlak van de EG. 3 , 4 volbloed kan worden gebruikt zonder toegevoegde anticoagulantia in deze instelling. Bloedmonsters kunnen worden genomen tijdens het experiment en cytokines, stollingsfactoren en oplosbare aanvulling activering markeringen kunnen worden gedetecteerd en kan worden gekwantificeerd. EG-gecoate microcarrier kralen, kunnen bovendien door confocale microscopie voor aanvulling en immunoglobuline depositie, alsmede de uitdrukking van de EG-markeringen voor activering te worden geanalyseerd. Een andere interessante toepassing omvat het testen van geneesmiddelen die worden verondersteld om te voorkomen dat endothelial cel activatie en dus coagulatie. 5 dit model niet volledig het vervangen van dierproeven, maar biedt een methode om te testen specifieke functionele hypothesen ex vivo cuvetten en dus vermindering van het aantal proefdieren bij het basisonderzoek op ischemie/reperfusie letsel of (xeno) transplantatie.
Het beschreven model werd gebruikt om na te bootsen van een xenotransplantatie bepalen in welke varkens aorta endotheliale cellen (PAEC) worden geteeld op de kralen microcarrier en geïncubeerd met hele, niet-vertonen menselijk bloed. Verschillende transgene PAEC, uitvoering van verschillende menselijke genen zoals CD46 voor de regulering van het complementsysteem en/of thrombomodulin (hTBM) voor de regulering van de stolling systeem, werden geanalyseerd voor hun anticoagulatie-eigenschappen. Endothelial cel activatie, aanvulling en stolling systemen zijn strak gecontroleerde en met elkaar verbonden. 6 daarom is het belangrijk om te begrijpen hoe de verschillende transgene cellen gedragen na blootstelling aan menselijk bloed met betrekking tot de adhesie molecuul expressie en cytokine release, vergieten van de glycocalyx en verlies van anticoagulatie eiwitten. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde model is geschikt voor coagulatie gerelateerde studies zodat de analyse van de verschillende aspecten van coagulatie en de wisselwerking daarvan met EG. 8 in xenotransplantatie onderzoek is het een nuttig systeem om te testen de anticoagulatie eigenschappen van verschillende genetisch gemanipuleerde varkens ECs na incubatie met menselijk bloed 9.
De belangrijkste stappen van het protocol zijn die zorgen voor volledige cel d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNSF, Grant No. 320030_156193). De auteurs bedanken Dr. Benoît Werlen voor het verstrekken van het Biosilon microcarrier kralen. Wij danken ook Prof. Hans Peter Kohler en Prof. André Haeberli voor hulp bij het opzetten van de microcarrier-bead model.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O’Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood – a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
- Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
- Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
- Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
- Cowan, P. J., d’Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
- Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
- Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
- Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
- Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
