3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価
Summary
全体、高血圧症非血の研究と凝固解析を可能にする生体外モデルを提案します。健康な内皮細胞の自然な抗凝固効果に依存するシステムの抗凝固療法と血管内皮細胞の活性化血液凝固になります。
Abstract
生体内で、内皮細胞は循環血液の自然な抗凝固療法のために重要です。その結果、血管内皮細胞の活性化は、血液凝固をもたらします。この現象は、虚血/再灌流障害、臓器移植、異種移植を含む前もって形成された抗ドナー抗体の存在下でのような多くの臨床状況で観察されます。モデルによると、3 r 基準 (削減、交換・洗練)培養内皮細胞の影響を検討する動物実験を減らすためには、血液凝固活性化は非常に望ましいでしょう。ただし、内皮細胞培養の一般的なフラット ベッド システムは、自然、内皮細胞を介した抗凝固療法の不十分な血の mL あたり内皮の 1 5 cm2の表面に容積比を提供します。マイクロ ・ キャリア ビーズに内皮細胞を培養すると、40-160 cm2/mL に表面・体積比が増加します。この増加率は、抗凝固薬の使用を避けることができるように、全血での「自然な」抗凝固療法を確実に十分です。ここで体外マイクロ ・ キャリア ・ ベース システムは全体、非高血圧症ひと血液の凝固に及ぼすブタ血管内皮細胞の遺伝子組み換えの研究に記載されています。説明アッセイがプライマリ ブタ大動脈の血管内皮細胞、いずれかの野生型 (WT) で遺伝子組み換え人間ありなさい CD46 および、トロンボモジュリンをマイクロ ・ キャリア ビーズ上に成長したて非高血圧症ヒトの血液にさらされるのか。このモデルは、補完性と、血漿中の血液凝固マーカー測定及び活性化と同様に、サイトカインのリリースの定量化できます。さらに、活性化血管内皮細胞および免疫グロブリンの沈着のイメージング、endothelialized ビーズの補完・凝固の蛋白質を行った共焦点顕微鏡。この試金は、血管内皮細胞の活性化や、したがって、凝固を防ぐためになっている薬をテストする使用できます。このような調査に使用される動物の数を減らすには、その可能性の上に説明アッセイは、簡単に実行で一貫して再現可能なです。
Introduction
血管内皮細胞は、血管の内腔を並べる内皮細胞 (EC) の単分子層で構成されます。生理学的な状態で静止 EC が抗凝固薬および抗炎症環境のメンテナンスを担当です。1これは抗凝固剤および EC 表面抗炎症タンパク質発現によって媒介されます。虚血・再灌流による EC 活性化たとえば、傷害または血管性拒絶反応 (xeno-) の移植臓器プロ凝固と炎症性抗凝固薬および抗炎症状態から内皮細胞表面の変化の結果状態です。1
内皮細胞と血液凝固の要因として模倣の in vitroモデルの魅惑的で複雑な相互作用を研究するには、可能な限り密接に体内の状況が非常に望ましい。凝固検査従来体外を特徴づける共通制限は高血圧症血液凝固性効果の解析を困難になるとの使用と全血のも領域を再現できません。高血圧症以外の新鮮な血液を用いて得られる結果。2以外にも、伝統的なフラット ベッド細胞培養システムで不可能血液量あたり十分な血管内皮細胞表面に到達できないと血管内皮細胞の抗凝固特性を悪用します。ここに提示されたモデル球状マイクロ ・ キャリア ビーズの表面に EC を養殖によるこれらの制限を克服しての EC 表面の血比 > 16 cm2/mL に到達でき、小細動脈や静脈の状況に似ているとこれは血液の「自然な」抗凝固療法を許可する十分な EC 表面によって記述されていた。3,4全血はこの設定で追加された抗凝固剤なし使用ことができます。凝固因子、サイトカイン、実験中に血液サンプルを集めることができると可溶性の補体の活性化マーカーを検出および定量化できます。さらに、EC コーティング マイクロ ・ キャリア ビーズは、共焦点顕微鏡による補体および免疫グロブリン沈着として EC 活性化マーカーの発現を分析することがあります。別の興味深いアプリケーションは、血管内皮細胞の活性化や、したがって、凝固を防ぐためになっている薬物の含まれています。5が、このモデルは、動物実験を完全に置き換えることはできません、それは特定機能仮説ex vivo細胞を使用してテストし、虚血/再灌流に関する基礎的研究に使用される動物の数を減らす方法を提供します。傷害または (ゼノ) の移植。
説明モデルは設定どのブタ大動脈内皮細胞 (PAEC) のマイクロ ・ キャリア ビーズ上に成長したおよび全体、非高血圧症血液で培養した異種を模倣する使用されました。補体系やトロンボモジュリン (hTBM) 凝固系の規則のための規則のためのありなさい CD46 などいくつかのひと遺伝子を運ぶ別のトランスジェニック PAEC は、その抗凝固特性分析しました。血管内皮細胞の活性化、補完、および凝固のシステムは堅く制御され、相互に連結されます。6様々 な形質転換細胞の接着分子の発現やサイトカインのリリースに関して人間の血液への暴露後動作方法を理解することが重要、そのための糖衣と抗凝固の蛋白質の損失を流します。7
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介するモデルは凝固に適して関連の研究凝固と理事会との相互作用のさまざまな側面の分析が可能8異種移植研究でヒトの血液9の孵化後異なる遺伝子組み換え豚 ECs の抗凝固特性をテストするための便利なシステムです。
プロトコルの最も重要な手順、実験を開始する前に、マイクロ ビーズの完全なセル範囲 (密度) を確保、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、スイスの全米科学財団 (SNSF、グラント号 320030_156193) によって支えられました。著者は、Biosilon マイクロ ・ キャリア ビーズを提供を博士 Benoît Werlen をありがちましょう。私たちはまたマイクロ ・ キャリア ビーズ モデルの設定のヘルプについて教授ハンス ・ ピーター ・ コーラーと教授アンドレ ・ Haeberli をありがちましょう。
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
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