Évaluation des propriétés anticoagulantes et anti-inflammatoires de cellules endothéliales à l’aide de la Culture cellulaire 3D et sang total Non-anticoagulant
Summary
Nous présentons un modèle in vitro qui permet l’étude et l’analyse de la coagulation dans le sang entier, de non anticoagulé. Anticoagulation dans le système dépend de l’effet anticoagulant naturel des cellules endothéliales saines et activation des cellules endothéliales se traduira par la coagulation.
Abstract
In vivo, les cellules endothéliales sont primordiales pour l’anticoagulation naturelle du sang circulant. Par conséquent, activation des cellules endothéliales entraîne la coagulation du sang. Ce phénomène est observé dans de nombreuses situations cliniques, comme la transplantation d’organes en présence d’anticorps d’anti-donneurs préformés, y compris la xénotransplantation, ainsi que dans la lésion d’ischémie/reperfusion. Afin de réduire l’expérimentation animale selon les 3R normes (remplacement, réduction et raffinement), in vitro modèles pour étudier l’effet des cellules endothéliales activation sur la coagulation du sang serait hautement souhaitable. Cependant, des systèmes de culture de cellules endothéliales à plat communs fournissent un rapport surface-volume 1-5 cm2 de l’endothélium par millilitre de sang, ce qui n’est pas suffisant pour traitement anticoagulant naturel, endothéliale induite. Mise en culture des cellules endothéliales avec des microporteurs perles peut accroître le ratio de surface-volume de 40 à 160 cm2/ml. Cet augmentation du rapport est suffisant pour assurer l’anticoagulation « naturelle » de sang, afin que l’utilisation des anticoagulants peut être évitée. Ici un in vitro avec des microporteurs système est décrit pour étudier les effets de la modification génétique de cellules endothéliales porcines sur la coagulation du sang entier, non anticoagulé. Dans l’essai décrit, principales cellules endothéliales aortiques porcines, soit type sauvage (WT) ou transgéniques pour humain CD46 thrombomoduline et ont été cultivées avec des microporteurs perles puis exposés au sang humain non-anticoagulé fraîchement tiré. Ce modèle permet la mesure et la quantification des cytokines comme activation marqueurs de complément et de la coagulation dans le plasma sanguin. En outre, l’imagerie de cellules endothéliales activées et des dépôts d’immunoglobulines, complément – et la coagulation des protéines sur les perles d’endothelialized ont été réalisées par microscopie confocale. Ce test permet également de tester des médicaments qui sont censés pour prévenir la coagulation et, par conséquent, activation des cellules endothéliales. Sur le dessus de son potentiel de réduire le nombre d’animaux utilisés pour de telles enquêtes, l’essai décrit est facile à réaliser et toujours reproductible.
Introduction
L’endothélium vasculaire est constitué d’une monocouche de cellules endothéliales (EC) qui bordent la lumière des vaisseaux sanguins. Dans un état physiologique, ce repos sont chargés de l’entretien d’un environnement anti-inflammatoire et un anticoagulant. 1 c’est médiée par l’expression d’anticoagulant et protéines anti-inflammatoires sur la surface de l’EC. Par exemple, activation de EC causée par l’ischémie/reperfusion blessures ou rejet vasculaire de (xeno-) transplantés entraîne une modification de la surface endothéliale d’un anticoagulant et anti-inflammatoires état pro-inflammatoire et Pro-coagulant organes État. 1
Pour étudier l’interaction fascinante et complexe entre les facteurs de l’endothélium et la coagulation, modèles in vitro qui imitent tant que possible la situation in vivo sont fortement souhaitables. Une limitation courante qui caractérise conventionnelles in vitro tests de coagulation est l’utilisation de sang non coagulé qui rend l’analyse des effets médiés par coagulation ardu et ne peut pas reproduire les même recalcification du sang citraté résultats obtenus avec du sang frais non-anticoagulé. 2 en outre, dans les systèmes de cultures cellulaires de plat traditionnel il est impossible d’exploiter les propriétés anticoagulantes de l’endothélium, comme une surface suffisante de cellules endothéliales par volume sanguin n’est pas joignable. Le modèle présenté ici permet de surmonter ces limitations en cultivant EC sur la surface des perles avec des microporteurs sphérique, alors qu’un ratio de surface-to-sang d’EC de > 16 cm2/ml peut être atteint, ce qui est similaire à la situation dans les petites artérioles ou veines, et suffisantes permettre à l’anticoagulation « naturelle » du sang, qui a été décrit par la surface de l’EC. 3 , 4 sang entier peut être utilisé sans anticoagulants ajoutés dans ce paramètre. Des échantillons de sang peuvent être collectées au cours de l’expérience et des cytokines, des facteurs de coagulation et marqueurs d’activation complément soluble peuvent être détectés et quantifiées. En outre, EC-enduit avec des microporteurs perles peuvent être analysées pour les dépôts d’immunoglobulines et de complément ainsi que l’expression des marqueurs d’activation EC par microscopie confocale. Une autre application intéressante comprend les essais de médicaments qui sont censés pour prévenir la coagulation et, par conséquent, activation des cellules endothéliales. 5 bien que ce modèle ne peut totalement remplacer l’expérimentation animale, elle offre une méthode pour tester les hypothèses fonctionnelles spécifiques ex vivo à l’aide de cellules et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche fondamentale sur l’ischémie/reperfusion transplantation des blessures ou (xeno).
Le modèle décrit a été utilisé pour imiter la xénotransplantation dans quelles cellules endothéliales aortiques porcines (PAEC) sont cultivées sur les perles avec des microporteurs et incubées en présence de sang entier, non anticoagulé. Différente PAEC transgénique, transportant plusieurs gènes humains tels que CD46 pour la régulation du système du complément et/ou thrombomoduline (hTBM) pour la régulation du système de la coagulation, ont été analysées pour leurs propriétés anticoagulantes. Systèmes d’activation, complément et coagulation de cellules endothéliales sont étroitement contrôlées et reliés entre eux. 6 il est donc important de comprendre comment les différentes cellules transgéniques se comportent après une exposition au sang humain, en ce qui concerne l’expression de molécule adhérence et cytokines, effusion du glycocalyx et une perte de protéines anticoagulantes. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle présenté ici est adapté pour la coagulation des études permettant l’analyse des différents aspects de la coagulation et de son interaction avec EC. 8 dans la recherche de la xénotransplantation, c’est un système utile pour tester les propriétés anticoagulantes de différents ECs porcins génétiquement modifiés après incubation avec le sang humain 9.
Les étapes plus critiques du protocole sont celles assurant la couvert…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la Swiss National Science Foundation (FNS, Grant No. 320030_156193). Les auteurs remercient Dr Benoît Werlen pour fournir les perles avec des microporteurs de Biosilon. Nous remercions également le Prof. Hans Peter Kohler et Prof. André Haeberli d’aide à la mise en place du modèle de perle avec des microporteurs.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
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