Summary

Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis

Published: November 16, 2017
doi:

Summary

We presenteren een protocol om te ontleden slijmachtige klieren en bereiden van hypofyse coronale secties van het ontwikkelen van muizen.

Abstract

De hypofyse of hypophysis is een belangrijk endocriene orgaan afscheidende hormonen essentieel voor homeostase. Het bestaat uit twee klieren met aparte embryonale oorsprong en functies — de neurohypophysis en de adenohypophysis. De ontwikkelende muis hypofyse is klein en delicaat met een langgerekte ovale vorm. Bij voorkeur wordt een coronale sectie weer te geven van zowel de adenohypophysis als de neurohypophysis in een enkel sneetje van de hypofyse muis.

Het doel van dit protocol is te bereiken van de juiste hypofyse coronale secties met goed bewaarde weefsel architecturen van het ontwikkelen van muizen. In dit protocol beschrijven we in detail hoe te ontleden en te verwerken van de slijmachtige klieren goed van de ontwikkeling van muizen. Eerst, muizen door transcardial perfusie van formaldehyde vóór dissectie worden opgelost. Vervolgens worden drie verschillende ontleden technieken toegepast om het verkrijgen intact slijmachtige klieren afhankelijk van de leeftijd van muizen. Voor foetale muizen van embryonale dagen (E) 17,5-18,5 en pasgeborenen jaar omhoog tot 4 dagen, worden de regio van de gehele sella’s waaronder het wiggenbeen, klier en trigeminus zenuwen ontleed. Voor pups worden leeftijd postnatale dagen (P) 5-14, de slijmachtige klieren verbonden met trigeminal zenuwen ontleed als een geheel. Voor muizen meer dan 3 weken oud, worden de slijmachtige klieren zorgvuldig ontleed gratis uit de omliggende weefsels. We tonen ook hoe de slijmachtige klieren insluiten in een goede richting met behulp van de omliggende weefsels als monumenten te verkrijgen die voldoen aan de coronale secties. Deze methoden zijn handig bij het analyseren van de histologische en ontwikkelingsproblemen functies van slijmachtige klieren bij de ontwikkeling van muizen.

Introduction

De hypofyse of hypophysis is een belangrijk endocriene orgaan afscheidende hormonen essentieel voor homeostase1,2. De hypofyse is anatomisch, een ” two-in-one” structuur bestaande uit de neurohypophysis en de adenohypophysis. Die onderdelen moeten verschillende embryonale oorsprong en functie zeer verschillend. De neurohypophysis is afgeleid van de neurale ectoderm en scheidt van oxytocine en veel hormoon. De adenohypophysis is afkomstig uit de zak van Rathke en is verantwoordelijk voor het vrijkomen van hormonen waaronder groei-hormoon prolactine, schildklier – stimulerend hormoon, follikelstimulerend hormoon, luteïniserend hormoon, adrenocorticotropic hormoon, en Melanocyt – stimulerend hormoon3,4,5.

De hypofyse berust op het dorsale oppervlak van het wiggenbeen (sella turcica) van de schedel van de muis en aan de verdieping van de hersenen is gekoppeld door een fragiele stengel. Lateraal is omgeven door trigeminal zenuwen en anteriorly de optic opticum6,7. De klier heeft een langwerpige ovale vorm met haar lange as loodrecht staat op die van het hoofd. Op het dorsale oppervlak, kunnen de neurohypophysis en de adenohypophysis gemakkelijk worden afgebakend, met de voormalige bezetten de dorsale mediale regio en de laatste uitbreiding lateraal en ventrally. Tijdens de postnatale ontwikkeling, neemt de grootte van hypofyse toe snel in de eerste maand na de geboorte8,9. De hypofyse muis is echter nog steeds zeer klein in grootte met een gemiddeld gewicht van 1.9 mg en een lange-as diameter van ~ 3 mm in volwassen10, een lange-as diameter van 2-2,5 mm op postnatale dag 21 (P21), en slechts 1-1,5 mm bij P0.

Een coronale sectie heeft de voorkeur om zowel adenohypophysis als neurohypophysis in een enkel sneetje van de hypofyse muis weer te geven. Echter, sommige technische vaardigheden worden vereist om te verkrijgen die voldoen aan de coronale secties van de slijmachtige klieren van het ontwikkelen van muizen vanwege zijn uitzonderlijk kleine formaat en verschillende anatomie. In dit artikel video laten we zien hoe ontleden muis slijmachtige klieren en hypofyse coronale secties voor te bereiden op de verschillende ontwikkelingsstadia.

Protocol

C57BL/6 muizen worden gefokt in omstandigheden van specifieke pathogenen vrije. Alle dierlijke experimentele methoden zijn in overeenstemming met de richtsnoeren die zijn goedgekeurd door de Animal Care en de ethische Commissie op tweede militaire Medizinische Universität. 1. dissectie van postnatale ontwikkeling hypofyse uitvoeren anesthesie: neonatale muizen (P0 – P5) plaats op crushed ijs voor het opwekken van hypothermie. Voor muizen die ouder zijn dan 5 dagen oud, injecteren …

Representative Results

Dit protocol biedt een methode om te ontleden slijmachtige klieren van het ontwikkelen van muizen. Voor de neonatale muis, de hele sella regio’s met de hypofyse, de trigeminus zenuwen en de onderzijde wiggenbeen werden ontleed uit vanaf de basis van de schedel. De kleine en delicate hypofyse tijdens het proces (figuur 1A) intact gebleven. Voor muizen die ouder zijn dan 5 dagen, toen de slijmachtige klieren gekoppeld aan de laterale trigeminal zenuwen waren ge…

Discussion

Voor het ontwikkelen van lymfkliertest pituitaries, is het technisch moeilijk te verkrijgen van de juiste coronale secties als gevolg van hun klein en kwetsbaar functies en unieke anatomische kenmerken6,8. Sommige onderzoeksgroepen koos dus mid-Sagittaal secties voor het analyseren van de morfologie van embryonale en neonatale hypofyse11,12. Hoewel de mid-Sagittaal sectie van hypofyse is ook geschikt voor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de subsidies van nationale Natural Science Foundation van China (31201086, 31470759 en 31671219) en Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900).

Materials

Tools/Equipment
Surgical scissors-straight JinZhong J21010 can be purchased from other vendors
Fine scissors-strainght JinZhong WA1010 can be purchased from other vendors
Blunt forceps JinZhong JD1020 can be purchased from other vendors
Fine forceps Dumont RS-5015 for isolation of the pituitary
26G (0.45mm) needle HongDa for transcardial perfusion
Syringe (1 mL) BD 300841 can be purchased from other vendors
Syringe (10 mL) BD can be purchased from other vendors
35mm dish Corning 430165 can be purchased from other vendors
Lens cleaning paper ShuangQuan can be purchased from other vendors
Anatomical microscope OLYMPUS SZX-ILLB2-200 can be purchased from other vendors
Embedding cassette Thermo Fisher 22-272423 can be purchased from other vendors
Tissue embedding console system KEDEE KD-BM11 can be purchased from other vendors
Microtome Thermo Fisher HM315R can be purchased from other vendors
Superfrost-Plus slides Thermo Fisher 22-037-246 can be purchased from other vendors
Cover glass Thermo Fisher 12-543 can be purchased from other vendors
Fluorescence microscope OLYMPUS BH2-RFCA can be purchased from other vendors
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Urethane BBI EB0448
NaCl Sigma S9625 for PBS
KCl Sigma P9541 for PBS
Na2HPO4.12H2O Sigma 71650 for PBS
K2HPO4 Sigma P2222 for PBS
NaNO2 Sigma 237213
Heparin Sodium Injection SPH H31022051 for perfusion saline
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Ethanol SCR 10009218
Xylene SCR 10023418
Paraffin Thermo Fisher 8330
Hematoxylin Sigma H9627 for H&E staining
Eosin Y Sigma E4009 for H&E staining
rabbit anti growth hormone (GH) National Hormone for immunostaining
antibody Pituitary Program
Rabbit anti-mouse GFAP antibody Sigma G9269 for immunostaining
Goat anti-rabbit IgG, HRP Jackson 111-035-003 for immunostaining
TSA system NEN Life Science Products NEL700 for immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher S32356 for immunostaining
Anti-FITC Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A11090 for immunostaining

References

  1. Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
  2. Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
  3. Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
  4. Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
  5. Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
  6. Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
  7. Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
  8. Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
  9. Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
  10. Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
  11. Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
  12. Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
  13. Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
  14. Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).

Play Video

Cite This Article
Cao, D., Ma, X., Zhang, W. J., Xie, Z. Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland. J. Vis. Exp. (129), e56356, doi:10.3791/56356 (2017).

View Video