Soro e Plasma cópia número deteção usando PCR em tempo real
Summary
Este manuscrito descreve a análise de variação número da cópia realizada em DNA de soro ou plasma utilizando a abordagem PCR em tempo real. Este método é adequado para a previsão da resistência a drogas em pacientes com câncer de próstata resistente a castração, mas poderia ser informativo também para outras doenças.
Abstract
Soro e plasma cell DNA gratuito (cfDNA) tem sido demonstrado como fonte informativa, não-invasivo de biomarcadores para diagnóstico de câncer, prognóstico, acompanhamento e previsão da resistência do tratamento. A partir da hipótese de que a ganhar o número de cópia de gene do andrógeno receptores (AR) (CN) é um evento frequente no cancro da próstata de castração metastático resistência (Abiraterona), propomo-na analisar este evento em cfDNA como um potencial biomarcador preditivo.
Nós avaliamos AR CN em cfDNA usando 2 diferentes ensaios PCR em tempo real e 2 genes de referência (RNaseP e AGO1). Quantidade de DNA de 60 ng foi usado para cada combinação de ensaio. AR Ganho de CN foi confirmado usando PCR Digital como um método mais preciso. Análise de variação de CN já foi demonstrado ser informativo para a previsão da resistência do tratamento no cenário do Abiraterona, mas pode ser útil também para outros fins em diferentes configurações de paciente. Análise CN na cfDNA tem várias vantagens: é não-invasiva, rápida e fácil de executar, e começa de um pequeno volume de material de soro ou plasma.
Introduction
Circular célula DNA gratuito (cfDNA) no sangue tem demonstrado para ser uma óptima fonte de biomarcadores para diagnóstico de câncer, prognóstico, acompanhamento e previsão de tratamento resistência1,2. Muitos estudos têm mostrado uma boa concordância entre alterações de DNA (mutações, variações de número de cópia, modificações epigenéticas em tecidos) e aqueles encontrados no correspondente plasma amostras1, confirmando que circulam o DNA do tumor (ctDNA) é informativo para o tumor primário e metastático tecido alterações3. A possibilidade de estudar ctDNA permite, assim, para a reconstrução de rearranjos do genoma e variações de número de cópia (CNVs) em oncogenes específicos4, identificando potencialmente metastáticas células clonais e subclonal. CtDNA tem demonstrado ser clinicamente útil especialmente para câncer tratamento monitoramento à medida que abriga mutações específicas e CNVs, relacionadas com terapias alvo específico5,6. Também supera a necessidade de biópsias do tecido e permite resultados a serem obtidos em diferentes momentos durante um tratamento de câncer específicos, de forma não-invasiva.
No que se refere a câncer de próstata, uma correlação significativa entre a circulação livre de células andrógeno CNVs do receptor (AR) e tratamento demonstrou-se a resposta a abiraterone e enzalutamide, indicando AR gene cópia número (CN) em cfDNA pode ser uma biomarcador promissor capaz de prever tratamento resistência7,8,9,10,11. CNVs de genes específicos no ctDNA podem ser avaliados usando diferentes abordagens com diferente sensibilidade, custo e rapidez (EG. PCR em tempo real, Digital e a próxima geração de sequenciamento).
Aqui nós descrevemos uma abordagem simples e rápida, com base em ensaios de frente e verso em tecnologia PCR em tempo real, para avaliar o AR CN em cfDNA de soro e plasma amostras7,8. Consideramos dois diferentes ensaios PCR concebidos em duas diferentes regiões genômicas dentro intron 5 do AR (Xq12) e dois outros genes, como genes de referência padrão interno, conhecidos por ter um status de número de cópia normal em câncer de próstata (RNaseP, localizado no 14q11; AGO1, localizado no 1 p. 34). Nós selecionamos os genes de duas referência, ao invés, para aumentar a precisão e a sensibilidade dos resultados. Uma quantidade de DNA de 60 ng foi amplificado para cada combinação de ensaio (ensaio combinado para AR-assay_1 + RNaseP e de AR-assay_2 + AGO1). Três amostras de DNA de soro ou plasma de homens saudáveis foram agrupadas e usadas como um calibrador. Consideramos a cortes de > 1.5 para ganho de AR e < 0.5 para exclusão. Uma das principais vantagens deste método é que é flexível e que outros genes podem também ser avaliados, alterando os genes de padrão interno de referência, com base no tipo de tumor e características.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR Análise CN em amostra de soro e plasma representa uma abordagem nova, não-invasivo para a estratificação de pacientes com câncer de próstata resistente a castração (CRPC). Foi recentemente demonstrado que a CN AR é capaz de prever os resultados no CRPC pacientes tratados com abiraterone e enzalutamide, antes e depois da quimioterapia7,8,9,10.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Chiara Molinari e Filippo Martignano para apoio na análise de dados.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
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