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生物化学

Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018
doi:
10.3791/56953
, ,
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

Cette méthode décrit le clonage, expression et purification de Nsa1 recombinant pour détermination structurale par diffraction des rayons x et la diffusion des rayons x de petits angles (SAXS) et est applicable pour l’analyse structurale de l’hybride d’autres protéines contenant à la fois ordonnée et désordonnée des domaines.

Abstract

Détermination de la structure pleine longueur de facteur d’assemblage de ribosome Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) est difficile à cause du désordre et de la protéase labile extrémité C-terminale de la protéine. Cet article décrit les méthodes pour purifier recombinant Nsa1 de S. cerevisiae pour l’analyse structurale par diffraction des rayons x et SAXS. Cristallographie aux rayons x a été utilisée pour résoudre la structure du domaine N-terminal WD40 bien ordonnée de Nsa1, et ensuite les SAXS a été utilisée pour résoudre la structure de l’extrémité C-terminale de la Nsa1 en solution. Données de diffusion solution a prélevé la pleine longueur Nsa1 en solution. Les amplitudes de diffusion théoriques sont calculées à partir de la structure cristalline à haute résolution de la domaine de WD40, et une combinaison de corps rigide et ab initio de modélisation révèle alors l’extrémité C-terminale de Nsa1. Grâce à cette approche hybride, la structure quaternaire de la protéine entière a été reconstruite. Les méthodes présentées ici devraient être généralement applicables pour la détermination de structure hybride d’autres protéines, composé d’un ensemble de domaines structurées et non structurées.

Introduction

Les ribosomes sont des machines de ribonucléoprotéine grand qui exécutent le rôle essentiel de la traduction des ARNm en protéines dans toutes les cellules vivantes. Les ribosomes sont composées de deux sous-unités qui sont produites dans un processus complexe appelé ribosome biogenèse1,2,3,4. Assemblage du ribosome eucaryote s’appuie sur l’aide de centaines d’Assemblée ribosomique essentiels facteurs2,3,5. Nsa1 (Nop7 associés 1) est un facteur d’assemblage de ribosomes eucaryotes qui est formellement requis pour la production de la grande sous-unité ribosomique6, et est connu comme WD-répétition contenant 74 (WDR74) au plus élevé des organismes7. WDR74 s’est avéré être requis pour la formation du blastocyste en souris8et le promoteur WDR74 est fréquemment muté dans les cellules de cancer9. Cependant, la fonction et des mécanismes précis de Nsa1/WDR74 dans l’assemblage du ribosome sont encore largement inconnus. Pour commencer à découvrir le rôle de Nsa1/WDR74 au cours de la maturation des ribosomes eucaryotes, multiples analyses structurelles ont été effectuées, y compris la cristallographie aux rayons x et petit angle de dispersion (SAXS) rayons x10.

Cristallographie aux rayons x, spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), microscopie électronique et SAXS sont tous importants techniques pour étudier la structure macromoléculaire. Taille, forme, disponibilité et stabilité des influences de macromolécules adaptée de la méthode de biologie structurale pour lesquels une macromolécule particulière sera le meilleure, cependant combinant plusieurs techniques grâce à une approche dite « hybride » devient un outil de plus en plus bénéfique11. En particulier, diffraction et SAXS sont puissants et complémentaires des méthodes pour la détermination de structure des macromolécules12.

Cristallographie fournit la structure atomique haute résolution allant de petites molécules à grande machinerie cellulaire telles que le ribosome et a conduit à de nombreuses percées dans la compréhension des fonctions biologiques de protéines et d’autres 13de macromolécules. En outre, conception de médicaments basée sur la structure exploite la puissance des structures cristallines pour l’amarrage moléculaire par des méthodes de calcul, ajoutant une dimension critique à la drogue découverte et développement14. Malgré son applicabilité large, souples et désordonnées des systèmes sont difficiles à évaluer par cristallographie puisque l’empilement cristallin peut être entravé ou cartes de densité d’électron peuvent être incomplètes ou de mauvaise qualité. À l’inverse, SAXS est une approche structurelle faible résolution et axée sur la solution capable de décrire les systèmes flexibles allant de boucles désordonnées et termini à protéines intrinsèquement désordonnées12,15,16. Vu qu’il est compatible avec un large éventail de tailles de particules12, SAXS peuvent agissent en synergie avec la cristallographie à élargir l’éventail des questions biologiques qui peuvent être traités par des études structurales.

Nsa1 est adapté pour une approche structurelle de l’hybride car il contient un domaine WD40 bien structuré, suivi d’un C-terminus fonctionnel, mais flexible qui n’est pas favorable à des méthodes de diffraction des rayons x. Voici un protocole pour le clonage, expression et purification de Nsa1 de S. cerevisiae pour la détermination de structure hybride par cristallographie aux rayons x et SAXS. Ce protocole peut être adapté pour étudier les structures d’autres protéines qui sont constituées d’une combinaison de régions ordonnées et désordonnées.

Protocol

1. recombinant Protein Production et Purification de RN 1 Nsa1 Expression plasmide Design et clonage Obtenir ou acquérir l’ADN génomique de S. cerevisiae . PCR amplifier les séquences cibles de Nsa1 (Nsa1FL, résidus 1-463) et C-terminal tronqué Nsa1 (Nsa1ΔC, résidus 1-434) avec des amorces appropriées à l’aide de l’ADN génomique isolé de S. cerevisiae et une température de fusion environ 60 ° C avec une prorogation de délai de 1 à 2…

Representative Results

Nsa1 était PCR amplification de l’ADN génomique de S. cerevisiae et subcloned dans un vecteur contenant une balise d’affinité N-terminal 6 x-Histidine suivie de MBP et un site de protéase TEV. Nsa1 fut transformé en cellules d’e. coli BL21 (DE3) et des rendements élevés de l’expression de la protéine ont été obtenues suite à induction avec IPTG et croissance à 25 ° C durant la nuit (Figure 1 a). Nsa1 a été purifiés pa…

Discussion

Utilisant ce protocole, recombinant Nsa1 de S. cerevisiae a été généré pour les études structurales par cristallographie aux rayons x et SAXS. Nsa1 s’est bien comporté en solution et cristallise sous plusieurs formes cristallines. Au cours de l’optimisation de ces cristaux, on a découvert que l’extrémité C-terminale de Nsa1 a été sensible à la dégradation de la protéase. La haute résolution, forme cristalline orthorhombique n’a pu être reproduite avec des variantes de troncation de C-ter…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diffraction des données ont été recueillies à Southeast Regional Collaborative Access Team (SER-CAT) 22-ID et 22-BM faisceaux à l’Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Les données SAXS ont été recueillies sur la ligne de faisceaux SIBYLLES à la Source de lumière avance (SLA), Lawrence Berkeley National Laboratory. Nous tenons à remercier le personnel à la source de rayonnement SIBYLLES pour leur contribution à la collecte de données à distance et le traitement. Nous sommes reconnaissants à la National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) recherche de spectrométrie de masse et le groupe de soutien pour aider à déterminer les limites du domaine protéine. Ce travail a été soutenu par l’U.S. National Institute de santé intra-muros recherche Program ; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 à R. E. S.) et les Instituts canadiens de recherche en santé (du Canada IRSC, 146626 à M.C.P). Utilisation de l’APS a été soutenue par le US Department of Energy, le Bureau de la Science, le Bureau des Sciences de l’énergie base sous le contrat no. W-31-109-Eng-38. Utilisation de l’Advanced Light Source (ALS) a été prise en charge par le directeur, Office of Science, Office de base Sciences de l’Energie, de l’US Department of Energy, sous le contrat no. DE-AC02-05CH11231. Un soutien supplémentaire pour le SIBYLLES SAXS beamline provient de l’Institut National de la santé du projet MINOS (R01GM105404) et un haut de gamme Instrumentation Grant S10OD018483. Nous tenons également à remercier Andrea Moon et Dr. Sara Andres pour leur lecture critique de ce manuscrit.

Materials

Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index  Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy  Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015
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Lo, Y., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).
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