La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae
Summary
Este método describe el clonaje, expresión y purificación de Nsa1 recombinantes para la determinación estructural por cristalografía de rayos x y dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) y es aplicable para el análisis estructural híbrido de otras proteínas que contiene tanto había ordenado y desordenado dominios.
Abstract
Determinación de la estructura integral del factor de ensamblaje del ribosoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es un reto debido a la desordenada y proteasa lábil c-término de la proteína. Este manuscrito describe los métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análisis estructural por cristalografía de rayos x y SAXS. Cristalografía de rayos x fue utilizado para resolver la estructura del dominio N-terminal WD40 ordenado de Nsa1, y luego SAXS se utilizó para resolver la estructura de la terminal C de Nsa1 en solución. Se recopilaron datos de dispersión de solución de larga duración Nsa1 en solución. Las amplitudes de la dispersión teórica se calcularon a partir de la estructura cristalina de alta resolución de dominio WD40, y luego una combinación de cuerpos rígidos y modelado ab initio reveló el c-término de Nsa1. A través de este enfoque híbrido fue reconstruida la estructura cuaternaria de la proteína entera. Los métodos presentados aquí deben ser generalmente aplicables para la determinación estructural híbrido de otras proteínas compuesto por una mezcla de dominios estructurados y no estructurados.
Introduction
Los ribosomas son máquinas grandes ribonucleoproteína que llevan a cabo el papel esencial de la traducción de mRNA en las proteínas en todas las células vivas. Los ribosomas están compuestos de dos subunidades que se fabrican en un proceso complejo llamado ribosoma biogénesis1,2,3,4. Ensamblaje del ribosoma eucariotas se basa en la ayuda de cientos de Asamblea ribosomal esenciales factores2,3,5. Nsa1 (Nop7 asociado 1) es un factor de ensamblaje ribosoma eucariota que es específicamente necesario para la producción de la subunidad ribosomal grande6, y es conocido como WD-repetición que contiene 74 (WDR74) en los organismos superiores7. WDR74 se ha demostrado que se requiere para la formación de blastocistos en ratones8y el promotor de WDR74 es frecuentemente mutado en cáncer células9. Sin embargo, la función y mecanismos precisos de Nsa1/WDR74 conjunto de ribosomas siguen siendo en gran parte desconocidos. Para comenzar a descubrir el papel de Nsa1/WDR74 durante la maduración de los ribosomas eucarióticos, se realizaron múltiples análisis estructurales, incluyendo la cristalografía de rayos x y ángulo pequeño (SAXS) la dispersión de rayos x10.
Cristalografía de rayos x, resonancia magnética nuclear (NMR) espectroscopia, microscopia electrónica y SAXS son técnicas importantes para el estudio de la estructura macromolecular. Tamaño, forma, la disponibilidad y estabilidad de las influencias de macromoléculas adecuado el método de la biología estructural que una macromolécula particular será mejor, sin embargo la combinación de múltiples técnicas a través de un enfoque llamado “híbrido” se está convirtiendo en un cada vez más beneficiosa herramienta11. En particular la cristalografía de rayos x y SAXS son métodos potentes y complementarios para la determinación estructural de macromoléculas12.
Cristalografía provee alta resolución estructuras atómicas que van desde moléculas pequeñas hasta grandes máquinas celulares como los ribosomas y ha conducido a numerosos avances en la comprensión de las funciones biológicas de las proteínas y otras macromoléculas13. Además, el diseño de fármacos basado en estructura aprovecha el poder de las estructuras cristalinas de acoplamiento molecular por métodos computacionales, añadiendo una dimensión crítica a drug discovery y desarrollo14. A pesar de su amplia aplicabilidad, sistemas flexibles y desordenados son difíciles de evaluar por cristalografía como embalaje de cristal puede ser obstaculizado o mapas de densidad de electrones pueden ser incompletas o de mala calidad. Por el contrario, SAXS es un enfoque estructural basado en la solución y baja resolución, capaz de describir sistemas flexibles que van desde bucles desordenados y termini a proteínas intrínsicamente desordenadas12,15,16. Teniendo en cuenta que es compatible con una amplia gama de tamaños de partícula12, SAXS puede trabajar sinérgicamente con Cristalografía para ampliar la gama de cuestiones biológicas que pueden ser abordadas por los estudios estructurales.
Nsa1 es adecuado para un enfoque estructural híbrido ya que contiene un dominio WD40 bien estructurado seguido de una funcional pero flexible C-terminal que no es sensible a los métodos de Cristalografía de rayos x. Siguiente es un protocolo para la clonación, expresión y purificación de Nsa1 S. cerevisiae para la determinación estructural híbrido por cristalografía de rayos x y SAXS. Este protocolo puede ser adaptado para estudiar las estructuras de otras proteínas que constan de una combinación de regiones ordenadas y desordenadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mediante este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae se generó para estudios estructurales por cristalografía de rayos x y SAXS. Nsa1 fue bien-se comportó en solución y cristalizado en múltiples formas de cristal. Durante la optimización de estos cristales, se descubrió que el C-terminal de Nsa1 era sensible a la degradación de la proteasa. La alta resolución, forma cristalina ortorrómbica sólo podría ser duplicada con variantes de truncamiento del c-terminal de Nsa1, probablemente porque el C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se recogieron datos de difracción en el equipo de acceso colaborativo Regional Sureste (SER-CAT) 22-ID y BM 22 líneas en la avanzada del fotón fuente (APS), laboratorio nacional de Argonne. Los datos SAXS se colectó en la línea de SIBILAS en avance luz fuente (ALS), laboratorio nacional Lawrence Berkeley. Nos gustaría agradecer al personal en la línea de SIBILAS por su ayuda con la recolección remota de datos y procesamiento. Agradecemos a la investigación de espectrometría de masa nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) y grupo de apoyo ayuda para determinar los límites del dominio de la proteína. Este trabajo fue apoyado por el nosotros nacional Instituto de salud intramuros programa de investigación; Los E.E.U.U. Instituto Nacional de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) (ZIA ES103247 a R. E. S.) y los institutos canadienses de investigación en salud (CIHR, 146626 a la M.C.P). Uso de la APS fue apoyado por el Departamento de energía, oficina de ciencia, oficina de ciencias básicas de energía bajo contrato no. W-31-109-Eng-38. Uso de la fuente de luz avanzado (ALS) fue apoyado por el Director, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, del Departamento de energía estadounidense bajo contrato no. DE-AC02-05CH11231. Soporte adicional para la línea de SAXS SIBILAS viene del Instituto Nacional de salud del proyecto MINOS (R01GM105404) y una gama alta instrumentación Grant S10OD018483. Nos gustaría también agradecer a Andrea Moon y el Dr. Sara Andres por su lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Primers for cloning Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
|
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
|
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
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| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
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| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
| EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
| Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
| HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
| Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
| Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
| Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
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