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生物化学

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018
doi:
10.3791/56953
, ,
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.

Abstract

Determinação da estrutura completo do fator de montagem do Ribossoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é um desafio por causa da desordenada e protease lábil C-terminal da proteína. Este manuscrito descreve os métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análise estrutural por cristalografia de raios x e SAXS. Cristalografia de raios x foi utilizada para resolver a estrutura do domínio N-terminal WD40 bem-ordenado de Nsa1, e em seguida SAXS foi usado para resolver a estrutura do C-terminal da Nsa1 em solução. Dados de dispersão de solução foi colhidos em longa-metragem Nsa1 em solução. Calcularam-se as amplitudes de espalhamento teórico da estrutura de cristal de alta resolução do domínio do WD40, e em seguida, uma combinação de corpo rígido e ab initio modelagem revelou o C-terminal da Nsa1. Através desta abordagem híbrida a estrutura quaternária da proteína inteira foi reconstruída. Os métodos apresentados aqui devem ser geralmente aplicáveis para a determinação estrutural de híbrido de outras proteínas, composto por uma mistura de domínios estruturados e não estruturados.

Introduction

Os ribossomas são máquinas de grande ribonucleoprotein que realizam o papel essencial de traduzir o mRNA em proteínas em todas as células vivas. Ribossomos são compostos por duas subunidades, que são produzidas em um processo complexo denominado Ribossoma biogênese1,2,3,4. Montagem do Ribossoma eucariota conta com a ajuda de centenas de montagem ribosomal essencial fatores2,3,5. Nsa1 (Nop7 associou 1) é um fator de montagem do Ribossoma eucariota que especificamente necessária para a produção do grande subunidade ribossomal6, e é conhecido como WD-repetição contendo 74 (WDR74) no maior organismos7. WDR74 tem demonstrado ser necessário para a formação de blastocistos em ratos8e o promotor de WDR74 é frequentemente uma mutação em células de câncer9. No entanto, a função e mecanismos precisos de Nsa1/WDR74 no assembly do Ribossoma ainda são em grande parte desconhecidos. Para começar a descobrir o papel de Nsa1/WDR74 durante o amadurecimento do Ribossoma eucariota, realizaram-se várias análises estruturais, incluindo cristalografia de raios x e pequeno ângulo de espalhamento (SAXS) de raio-x10.

Cristalografia de raios x, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), microscopia eletrônica e SAXS são todos importantes técnicas para estudar a estrutura macromolecular. Tamanho, forma, disponibilidade e estabilidade das influências de macromoléculas, o método de biologia estrutural, para o qual uma macromolécula particular será melhor adequado, no entanto, combinar várias técnicas através de uma abordagem so-called “híbrido” está se tornando um ferramenta cada vez mais benéfico11. Em particular, cristalografia de raios x e SAXS são complementares e poderosos métodos para determinação estrutural de macromoléculas12.

Cristalografia fornece estruturas atômicas de alta resolução, variando de pequenas moléculas a grande maquinaria celular, tais como o ribossoma e levou a inúmeros avanços na compreensão das funções biológicas das proteínas e outros macromoléculas13. Além disso, o design de drogas baseado em estrutura aproveita o poder da estruturas de cristal para encaixe molecular por métodos computacionais, acrescentando uma dimensão crítica a droga descoberta e desenvolvimento de14. Apesar de sua ampla aplicabilidade, sistemas flexíveis e desordenados são difíceis de avaliar por cristalografia, desde que a embalagem de cristal pode ser prejudicada ou mapas de densidade de elétrons podem ser incompletos ou de má qualidade. Por outro lado, SAXS é uma abordagem estrutural baseada em solução e baixa resolução capaz de descrever sistemas flexíveis, variando de loops desordenados e termini a proteínas intrinsecamente desordenado12,15,16. Considerando que é compatível com uma ampla gama de tamanhos de partículas12, SAXS pode trabalhar em sinergia com cristalografia para ampliar o leque de questões biológicas que podem ser abordados pelos estudos estruturais.

Nsa1 é apropriado para uma abordagem estrutural de híbrido, porque ele contém um domínio WD40 bem estruturado, seguido de um C-terminal funcional, mas flexível que não é passível de métodos de cristalografia de raios x. A seguir é um protocolo para a clonagem, expressão e purificação de S. cerevisiae Nsa1 para determinação estrutural híbrido por cristalografia de raios x e SAXS. Este protocolo pode ser adaptado para estudar as estruturas de outras proteínas que são compostas por uma combinação de regiões ordenadas e desordenadas.

Protocol

1. recombinação da proteína produção e purificação da Nsa 1 Design de plasmídeo de expressão Nsa1 e clonagem Obter ou comprar o DNA genômico de S. cerevisiae . PCR amplificar sequências alvo de Nsa1 (Nsa1FL, resíduos 1-463) e C-terminal truncado Nsa1 (Nsa1ΔC, resíduos 1-434) com primers apropriados usando o DNA genômico de isolados de S. cerevisiae e uma temperatura de fusão aproximadamente 60 ° C com um tempo de extensão de 1-2 min. O…

Representative Results

Nsa1 foi PCR amplificados de DNA genômico de S. cerevisiae e subcloned em um vetor que contém uma marca de afinidade de 6 x-histidina N-terminal seguida de MBP e um site de protease TEV. Nsa1 transformou-se em células de Escherichia coli BL21(DE3) e rendimentos elevados da expressão da proteína foram obtidos após indução com IPTG e crescimento a 25 ° C durante a noite (figura 1A). Nsa1 foi afinidade-purified na resina de afinidade d…

Discussion

Usando este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae foi gerado por estudos estruturais por cristalografia de raios x e SAXS. Nsa1 foi bem comportado na solução e cristalizado em múltiplas formas de cristal. Durante a otimização destes cristais, foi descoberto que o C-terminal da Nsa1 era sensível à degradação de protease. A alta resolução, forma de cristal ortorrômbico só poderia ser duplicada com variantes de truncamento do C-terminal do Nsa1, provavelmente porque o C-terminal flexível de Ns…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Difração foram recolhidos no sudeste equipe acesso Regional colaborativa (SER-CAT) 22-ID e 22-BM de luz síncroton no Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Os dados SAXS foi coletados sobre a trajetória de SIBILAS no avanço luz fonte (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Gostaríamos de agradecer o pessoal da trajetória de SIBILAS por sua ajuda com a coleta de dados remoto e processamento. Estamos gratos à pesquisa de espectrometria de massa nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e grupo de apoio para ajudar a determinar os limites do domínio da proteína. Este trabalho foi apoiado nos Instituto de saúde Intramural pesquisa programa nacional; E.U. Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) (ZIA ES103247 de R. E. S.) e os institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR, 146626 para M.C.P). Uso de APS foi apoiado pelo departamento de energia, escritório de ciência, escritório de energia ciências básicas sob contrato n º W-31-109-Eng-38. Uso da fonte de luz avançado (ALS) foi apoiado pelo Director, Office of Science, escritório de energia ciências básicas, o departamento de energia dos EUA, sob contrato n º DE-AC02-05CH11231. Suporte adicional para a trajetória de SIBILAS SAXS vem do Instituto Nacional de saúde do projeto MINOS (R01GM105404) e um high-end instrumentação Grant S10OD018483. Também gostaríamos de agradecer a Andrea Moon e Dr. Sara Andres por sua leitura crítica deste manuscrito.

Materials

Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index  Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy  Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015
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Lo, Y., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).
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