Summary

استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات

Published: May 19, 2018
doi:

Summary

ويصف البروتوكول المعروضة هنا منبر لتحديد الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد. ويرد وصف خطوة بخطوة تفاصيل كيفية التفريق بين إيبسكس في الخلايا التي تحتوي على خصائص تتمثل في لوحات 96-جيدا، واستخدام الخلايا للشاشة للجزيئات الصغيرة مع الأنشطة العلاجية المحتملة.

Abstract

القدرة على تمييز الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (إيبسكس) إلى الخلايا مثل تتمثل (عملية) يوفر فرصاً جديدة لدراسة أخطاء فطرية في الأيض الكبدي. ومع ذلك، يتطلب الإجراء توفير منبر يعتمد تحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تستخدم لعلاج أمراض الكبد، ثقافة بتنسيق متوافق مع فحص آلاف مركبات. هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام ثقافة محددة تماما الظروف التي تسمح للتفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل في زراعة الأنسجة 96-جيدا لوحات استنساخه. كما أننا نقدم مثالاً على استخدام المنصة لمركبات الشاشة لقدرتها على خفض الابوليبوبروتين ب (أبوب) تنتج من خلايا الكبد المتولدة من مريض الكوليستيرول عائلية المستمدة من اللجنة التوجيهية. توافر منصة متوافق مع اكتشاف المخدرات ينبغي السماح للباحثين التعرف على علاجات جديدة للأمراض التي تؤثر على الكبد.

Introduction

ويعتمد النجاح في تحديد الأدوية التي يمكن استخدامها لاستهداف مرض نادر على تطوير الاختبارات التي يمكن استخدامها لفرز. الفرضية أو الشاشات المستندة إلى الهدف (عكس الصيدلة) مفيدة ولكن تحتاج إلى فهم تفصيلي للأساس الجزيئي للمرض. شاشات المظهرية (علم الصيدلة الكلاسيكي) تجنب الحاجة إلى فهم تفصيلي للمسارات البيوكيميائية، ولكن بدلاً من ذلك تعتمد على تطوير النماذج التي تعكس بدقة الفسيولوجيا المرضية لهذا المرض. وعلى الرغم من الحماس للنهج المستندة إلى الهدف، تكشف التحاليل المخدرات إدارة الأغذية والعقاقير المعتمدة في الدرجة الأولى أن شاشات المظهرية كانت أكثر نجاحا بكثير1. والهدف العام لهذا الأسلوب إنشاء منبر للإنتاجية العالية الفحص التي يمكن استخدامها لتحديد الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد الأيضية. وقد وصفت عدة نماذج في المختبر بما في ذلك خلايا الكبد الأولية والخلايا الكبدي و الخلايا السلف الكبد2. ومع ذلك، معظم هذه النماذج على قيود، وهناك حاجة للنماذج الجديدة التي يمكن أن الخص بدقة الفسيولوجيا المرضية لقصور الكبد الأيضية في الثقافة. في الآونة الأخيرة، الخلايا الجذعية pluripotent البشرية جنبا إلى جنب مع تحرير الجينات قد أتاح فرصة لنموذج حتى أندر من الأمراض النادرة في الثقافة دون الحاجة إلى الوصول إلى المرضى مباشرة3. أثناء استخدام إيبسكس الخاصة بالمريض كما أداة لاكتشاف الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد نادرة معقولة من الناحية المفاهيمية، هناك فقط عدد قليل من التقارير التي تثبت جدوى هذا النهج4. ومع ذلك، أنشأنا مؤخرا منصة التي تستخدم خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية لتحديد الأدوية التي يمكن إعادة توجيه الغرض منه لعلاج أوجه القصور في الأيض الكبد5بنجاح.

ويوضح هذا البروتوكول عملية التفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل في لوحات 96-جيدا واستخدامهم للشاشة مكتبة جزيئات الصغيرة. فهو يصف أيضا تحليل نقطة النهاية باستخدام الكوليستيرول كمثال على أمراض الكبد الأيضية. ينبغي أن يكون هذا النهج مفيداً لدراسة دور والتطبيق من الجزيئات الصغيرة في سياق أمراض الكبد المعدية وأمراض الكبد الأيضية وسمية العقاقير وغيرها من اضطرابات الكبد.

Protocol

1-ثقافة الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent طلاء الماشوب البشري ه-كادهيرين Fc الانصهار البروتين (E-كندي-Fc) أو المصفوفات الأخرى مناسبة للثقافة هبسك 6 تمييع ه-كندي-Fc إلى 15 ميكروغرام/مل مع دولبيكو ‘s “فوسفاتيبوفيريد المالحة” التي تحتوي على الكالسيوم والمغن?…

Representative Results

الجيل تتمثل – مثل الخلايا: ويصف الشكل 1 الإطار الزمني للتغييرات التي تحدث أثناء التفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل. ثقافة إيبسكس في ه-كندي-نادي يوفر حوالي 2 مم قطر المستعمرات التي تعبر عن علامة pluripotent OCT4 (…

Discussion

الهدف على أساس اكتشاف العقاقير، حيث يتم تحديد الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على نشاط البروتين محددة، محط اهتمام العديد من الجهود فرز القائمة. رغم أن هذا النهج قد قدمت عديدة المستحضرات الصيدلانية، شاشات استناداً إلى عكس النمط الظاهري، علم الصيدلة الكلاسيكي، كانت أكثر نجاحا في تحديد المركبا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” (DK55743، DK087377، DK102716، و HG006398 إلى احظ). ونود أن نشكر الدكتور بيهشاد بورنصر، والدكتور جيمس Heslop وجينغ ران لمساهماتها.

Materials

100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered?. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Play Video

Cite This Article
Liu, J., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

View Video