Summary

À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

Published: May 19, 2018
doi:

Summary

Le protocole présenté ici décrit une plate-forme pour l’identification de petites molécules pour le traitement des maladies du foie. On présente une description étape par étape détaillant comment de CISP se différencient en cellules ayant des caractéristiques d’hépatocytes en plaques à 96 puits et d’utiliser les cellules pour dépister les petites molécules ayant une activité thérapeutique potentielle.

Abstract

La capacité de différencier les cellules souches humaines pluripotentes induites (CISP) en cellules semblables à des hépatocytes (HLCs) offre de nouvelles possibilités pour l’étude des erreurs innées du métabolisme hépatique. Toutefois, afin de fournir une plate-forme qui prend en charge l’identification de petites molécules qui peut potentiellement être utilisé pour traiter les maladies du foie, cette procédure nécessite un format de culture qui est compatible avec des milliers de composés de dépistage. Nous décrivons ici un protocole utilisant des conditions de culture entièrement définie, qui permettent la différenciation reproductible de CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes en plaques 96 puits vitroplants. Nous fournissons également un exemple d’utilisation de la plateforme aux composés d’écran pour leur capacité d’abaisser l’apolipoprotéine B (APOB) produite à partir des hépatocytes iPSC dérivés produits d’un patient de l’hypercholestérolémie. La disponibilité d’une plate-forme qui est compatible avec la découverte de médicaments devrait permettre aux chercheurs d’identifier de nouveaux traitements pour les maladies qui affectent le foie.

Introduction

Succès dans l’identification des médicaments qui peuvent servir à cibler une maladie rare se fonde sur le développement de tests qui peut être utilisé pour le dépistage. Hypothèse ou écrans axée sur la cible (pharmacologie inverse) sont utiles, mais nécessitent une compréhension détaillée de la base moléculaire de la maladie. Les écrans phénotypiques (pharmacologie classique) éviter la nécessité d’une compréhension détaillée des voies biochimiques, mais reposent plutôt sur l’élaboration de modèles qui reflètent avec précision la physiopathologie de la maladie. Malgré l’enthousiasme pour les approches axées sur la cible, des médicaments de première catégorie approuvés par la FDA, les analyses révèlent que phénotypiques écrans ont été beaucoup plus de succès1. L’objectif général de cette méthode est d’établir une plateforme de criblage à haute qui peut être utilisé pour identifier de petites molécules pour le traitement d’une maladie métabolique du foie. Plusieurs modèles in vitro ont été décrits, notamment des hépatocytes primaires et cellules d’hépatome de cellules progénitrices du foie2. Cependant, la plupart de ces modèles ont des limites, et on a besoin de nouveaux modèles peuvent récapituler avec précision la physiopathologie des déficiences métaboliques de foie dans la culture. Récemment, les cellules souches pluripotentes humaines combinées avec l’édition de gène ont offert une occasion de modèle même les plus rares de maladies rares en culture sans la nécessité d’accès patients directement3. Tandis que l’utilisation du CISP spécifique au patient comme un outil à la découverte de petites molécules pour le traitement des maladies hépatiques rares est raisonnable sur le plan conceptuel, il y a seulement quelques rapports démontrant la faisabilité de cette approche4. Cependant, nous avons récemment établi une plateforme dérivés iPSC hépatocytes permettant d’identifier avec succès des médicaments qui peuvent être réutilisés pour le traitement des déficiences dans le métabolisme du foie5.

Ce protocole explique le processus de différenciation CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes en plaques 96 puits et en les utilisant pour cribler une banque de petites molécules. Il décrit également l’analyse de point de terminaison utilisant hypercholestérolémie comme un exemple d’une maladie métabolique du foie. Cette approche devrait être utile pour étudier le rôle et l’application de petites molécules dans le cadre d’une maladie infectieuse du foie, hépatopathie métabolique, toxicité des médicaments et autres troubles du foie.

Protocol

1. culture de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes Revêtement recombinant humain protéine de Fusion Fc E-cadhérine (E-cad-Fc) ou autres matrices appropriés pour la culture de hPSC 6 Diluer le E-cad-Fc à 15 μg/mL avec Phosphate-Buffered Saline de Dulbecco contenant du calcium et du magnésium (SPD (+)). Manteau plats de vitroplants de suspension 100 mm avec 5 mL de E-cad-Fc dilué et incuber à 37 ° c pendant au moins 1 h su…

Representative Results

Génération des hépatocytes – aime les cellules : La figure 1 représente le calendrier des changements qui se produisent au cours de la différenciation du CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes. La culture de la CISP sur E-Cad-Fc fournit environ 2 mm des colonies de diamètre qui expriment le marqueur pluripotentes OCT4 (Figure 1 a-B). La mor…

Discussion

Découverte de médicaments cible basé, où les petites molécules sont identifiées qui influent sur l’activité d’une protéine spécifique, a fait l’objet de nombreux efforts de dépistage existants. Bien que cette approche a fourni de nombreux produits pharmaceutiques, écrans, basés sur l’inversion d’un phénotype, la pharmacologie classique, ont eu plus de succès dans l’identification des composés de première catégorie qui ont été cliniquement efficace1. Un inconvénient …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 et HG006398 de Sad). Nous tenons à remercier le Dr Behshad Pournasr, Dr. James Heslop et Ran Jing pour leurs contributions.

Materials

100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

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Cite This Article
Liu, J., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

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