Summary

Usando humanos inducida por células de hepatocito-como derivado de células madre pluripotentes de descubrimiento de fármacos

Published: May 19, 2018
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Summary

El protocolo que presentamos describe una plataforma para la identificación de pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática. Se presenta una descripción paso a paso detallando cómo iPSCs se diferencian en células con características de hepatocitos en placas de 96 pocillos y utilizar las células para detectar pequeñas moléculas con potencial actividad terapéutica.

Abstract

La capacidad de las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSCs) se diferencian en células similares a hepatocitos (HLCs) proporciona nuevas oportunidades para el estudio de errores innatos en el metabolismo hepático. Sin embargo, para proporcionar una plataforma que apoya la identificación de pequeñas moléculas que potencialmente pueden utilizarse para tratar la enfermedad hepática, el procedimiento requiere un formato de cultura que es compatible con la proyección de miles de compuestos. Aquí, describimos un protocolo usando las condiciones de cultivo totalmente definidos, que permiten la diferenciación reproducible de iPSCs humano a hepatocitos como las células en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. También ofrecemos un ejemplo del uso de la plataforma a los compuestos de la pantalla por su capacidad para bajar la apolipoproteína B (APOB) producido a partir de derivados de iPSC hepatocitos generados a partir de un paciente de hipercolesterolemia familiar. La disponibilidad de una plataforma que sea compatible con el descubrimiento de medicamentos debería permitir a los investigadores identificar nuevas terapias para enfermedades que afectan el hígado.

Introduction

Éxito en la identificación de los medicamentos que pueden usarse para atacar una enfermedad rara se basa en el desarrollo de los análisis que pueden utilizarse para la investigación. Hipótesis o pantallas basado en destino (farmacología inversa) son útiles, pero requieren una comprensión detallada de la base molecular de la enfermedad. Pantallas fenotípicas (farmacología clásica) evitar la necesidad de una comprensión detallada de las vías bioquímicas, pero en lugar de otro confían en el desarrollo de modelos que reflejan con exactitud la fisiopatología de la enfermedad. A pesar del entusiasmo de los enfoques basados en el objetivo, análisis de drogas de primera clase aprobado por la FDA revelan que pantallas fenotípicos han sido mucho más exitosa1. El objetivo general de este método es establecer una plataforma de alto rendimiento de detección pueden utilizarse para identificar pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática metabólica. Se han descrito varios modelos en vitro incluyendo primarias hepatocitos, células de hepatoma y de células progenitoras hepáticas2. Sin embargo, la mayoría de estos modelos tienen limitaciones, y hay una necesidad de nuevos modelos que pueden recapitular con exactitud la fisiopatología metabólica hepática deficiencias en la cultura. Recientemente, las células de vástago pluripotent humanas combinadas con la edición de genes han ofrecido una oportunidad para modelar las más raras de las enfermedades raras en la cultura sin la necesidad de acceso a pacientes directamente3. Mientras que el uso de iPSCs específico para cada paciente como una herramienta para descubrir pequeñas moléculas para el tratamiento de las enfermedades hepáticas raras es razonable conceptualmente, hay solamente algunos informes demostrando la factibilidad de este enfoque4. Sin embargo, recientemente hemos establecido una plataforma que utiliza hepatocitos derivados de iPSC para identificar con éxito fármacos que pueden reutilizar para el tratamiento de las deficiencias en el metabolismo del hígado5.

Este protocolo explica el proceso de diferenciación humana iPSCs a hepatocitos como las células en placas de 96 pocillos y usarlos para una biblioteca de moléculas pequeñas de la pantalla. También describe el análisis de punto final con hipercolesterolemia como un ejemplo de enfermedad hepática metabólica. Este enfoque puede ser útil para estudiar el papel y la aplicación de moléculas pequeñas en el contexto de enfermedad infecciosa del hígado, enfermedades hepáticas metabólicas, toxicidad de la droga y otros trastornos del hígado.

Protocol

1. cultura de humanos inducida por las células de vástago Pluripotent Capa recombinante proteína de fusión Fc E-Cadherin humana (E-cad-Fc) u otras matrices adecuados para hPSC cultura 6 Diluya en E-cad-Fc a 15 μg/mL Phosphate-Buffered solución salina de Dulbecco que contiene calcio y magnesio (DPBS (+)). Platos de cultivo de tejidos de suspensión de 100 mm con 5 mL de diluido E-cad-Fc la capa, incubar a 37 ° c por al menos 1 h. Retire sustrato…

Representative Results

Generación de hepatocitos – como células: La figura 1 describe el calendario de los cambios que ocurren durante la diferenciación de iPSCs humano a hepatocitos como las células. La cultura de iPSCs E-Cad-FC proporciona aproximadamente 2 mm colonias de diámetro que expresan el marcador de pluripotent OCT4 (figura 1A-B). La morfología de las células en una m…

Discussion

Objetivo basado en el descubrimiento de medicamentos, donde se identifican pequeñas moléculas que influyen en la actividad de una proteína específica, ha sido el foco de muchos esfuerzos de investigación existentes. Aunque este enfoque ha proporcionado numerosos productos farmacéuticos, pantallas basados en revertir un fenotipo, la farmacología clásica, han tenido más éxito en la identificación de compuestos de primera clase que han sido clínicamente eficaz1. Una desventaja para el des…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (DK55743, DK087377, DK102716 y HG006398 a S.A.D). Nos gustaría agradecer al Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop y Jing Ran sus contribuciones.

Materials

100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

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Cite This Article
Liu, J., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

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