Summary

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Published: April 10, 2018
doi:

Summary

אנו מתארים פרוטוקול פשוט וקל למדידת שיפור התלויים נוגדנים לזיהום על ידי Zika וירוס הבראה בנסיוב באמצעות וירוס דנגה כתב נגיפים.

Abstract

שיפור התלויים נוגדנים לזיהום הוכח לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה נגיפי קדחת דנגה. מבחני מסורתי המודדים את הקיבולת של נוגדנים או סרום כדי לשפר הידבקות שורות תאים שבידנו צריכים לסמוך על באמצעות פלט ויראלי בתקשורת ואחריו פלאק מבחני לכמת זיהום. לאחרונה, מבחני אלו בחנו דנגה זיהום בנגיף (DENV) בשורות תאים באמצעות נוגדנים fluorescently עם תוויות. שתי גישות אלה יש מגבלות שמגבילות את השימוש הנרחב של טכניקות אלה. כאן, אנו מתארים assay פשוט במבחנה באמצעות דנגה כתב ויראלי חלקיקי וירוס (RVPs) המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק ותאים K562 לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהום DENV השימוש סרום זה היה המתקבלים רזוס קופי מקוק 16 שבועות לאחר ההדבקה בנגיף Zika (ZIKV). טכניקה זו הוא אמין, כרוך מניפולציה מינימלי של תאים, אינו כרוך השימוש של וירוס המוסמכת שכפול בשידור חי, יכול להתבצע בתבנית תפוקה גבוהה כדי לקבל בדיקה כמותית באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, וזמינותו זו ניתן להתאים בקלות לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהומים נוספים flavivirus כגון נגיף קדחת צהובה (YFV), וירוס. קדחת מוח הסוסים יפני (JEEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) שבו זמינות RVPs וכו. הקלות של הגדרת וזמינותו, ניתוח הנתונים, ופרשנות תוצאות הופך לבצע רוב ההגדרות מעבדה.

Introduction

נוגדן התלויים שיפור (איד) של זיהום הוא תהליך לפיה תגובות נוגדנים cross-reactive חלקית המושרה על ידי serotype של וירוס משפר ספיגת של serotype נוספת של וירוס, המוביל שכפול ויראלי מוגברת viremia. אייד תועד בהרחבה דנגה זיהומים וירוס (DENV) שבו ארבע הגדולות אשר נגרמו מהזנים אליהם גם הם נפוצים. בקבוצת משנה של חולים, אייד משויכת קדחת דנגה מדמם (DHF). לאחרונה הראינו כי זיהום בנגיף (ZIKV) Zika המושרה רמות גבוהות באופן משמעותי של תגובות נוגדנים cross-reactive DENV גרם אייד של DENV חוץ גופית בתוך , סביר להניח תרמו שיפור DENV viremia in vivo1 , 2. מבחני שיפור התלויים נוגדנים הם כלי חשוב כדי להעריך את הקיבולת של נוגדנים כדי לשפר את זיהום משני עם וירוסים הקשורים ואת לספק תובנות לתוך בפתוגנזה של זיהומים flavivirus ליידע פיתוח חיסונים.

וזמינותו המתוארים כאן משתמש DENV RVPs יחד עם תאים K562, כי הם בדרך כלל שבידנו לזיהום. RVPs הם שכפול מבנית כשירים DENV חלקיקים נגיפיים אשר קידוד של replicon תת-גנומית חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הבאה לידי ביטוי לאחר סבב אחד של שכפול3. ככזה, תאים נדבקים בנגיף RVPs לזרוח ירוק, ניתן בקלות להבחין באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופ. RVPs בשימוש assay זו התקבלו ממקורות מסחריים. הם יכולים, לעומת זאת, להיות שנוצר נגד וירוסים אחרים, המשמשים וזמינותו המתואר בכתב היד. בינתיים, תאים K562 הם FcγIII-קולטן-הבעת ‘ לוקמיה תא קו לאגד האזור Fc של נוגדנים, להידבק בנוכחות תת נטרול ריכוזים של נוגדן4,5.

מבחני אייד שימשו בהרחבה מחקרים חוקרת את גורמי הסיכון עבור דנגה חמור וכדי ניסחו את המנגנונים של במבחנה אייד6,7,8. וזמינותו אייד המתוארים כאן יכול בקלות ובמהירות לשמש כדי לקבוע את הקיבולת של נסיוב flow cytometry, לעומת שאר מבחני בשימוש כיום, אשר דורשים גם הקביעה של פלאק ויוצרים ולשפר במבחנה זיהום באמצעות RVPs יחידות (pfu) ורו תאים או נוגדן כתמים נגוע תאים6,7,8,9,10,11, שניהם נמצאים זמן רב ודיני אינטנסיבית.

Protocol

הדוגמאות סרום בשימוש כדי להדגים את הפרוטוקול המתואר כאן, התקבלו קופי מקוק רזוס שהיו שוכנו, בהתאם במדינת מקומיים, ושלמישהו אכפת הפדרלית מדיניות שיוך עבור הערכת ולדאוג הסמכה של מעבדה חיה הבינלאומי (AAALAC)-מוכר מתקן. כל ניסויים בבעלי חיים היו נבדקו ואושרו על-ידי אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימו…

Representative Results

שרה מ 4 רזוס קופי מקוק היו שנאספו 16 שבועות לאחר ההדבקה עם ZIKV ונבדק את הפוטנציאל שלהם לשפר את DENV-1, 2, 3 ו 4 זיהום בתאים K562. החיות היו נגיפי ~ 1 x 105 עותקים של RNA ZIKV/mL של פלסמה ביום 3 לאחר זיהום ירדו לרמות שהיו מתחת לגבול של זיהוי על ידי 7 ימים לאחר ההדבקה. Viremia לא זוהה הפלזמה-16 שבו…

Discussion

Flaviviruses כגון DENV ו- ZIKV לשתף עדויות משמעותיות של הומולוגיה בחלבונים שני שלהם מבניים שאינן מבניות המייצרים נוגדנים cross-react אחד עם השני13,14. תגובות cross-reactive נוגדנים אלה הוכחו לשפר לזיהום הן ויוו והן במבחנה עם heterologous serotype או אחרים הקשורים flaviviruses1<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

הפרויקט המתוארת נתמכה על ידי כספים באוניברסיטת שירותי במדים של מדעי הבריאות כדי JJM. דעתם או את הנחרצות הכלול הם אלה פרטי של המחברים ואינם להיות לפרש הרשמי או המשקף את הנופים של משרד ההגנה, באוניברסיטת שירותי במדים של מדעי הבריאות או בכל חברה אחרת של ארצות הברית הממשלה.

WGV ביצע את כל הניסויים וניתח את הנתונים; JJM עוצב והשגחת המחקר; WGW JJM כתבו בעיתון.

Materials

DENV 1-4 RVP Integral Molecular RVP-501
K562 cells ATCC CCL-243
RPMI Corning 10-040-CV
FBS GE lifesceinces SH 30910.03 10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin MP biomedicals 1670049 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES Cellegro 25-060-Cl 0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145 1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate Cellegro 25-000-Cl 1mM in RPMI-10
L-glutamine Fisher Scientific MT25005CI 
Sterile V-bottom plates Thomas Scientific 333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes VWR 60819-728
Non-sterile U-bottom plates Falcon Ref 353910 A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette Denville P7127
200uL sterile pipette tips Denville P3020 CPS
20uL sterile pipette tips Denville P1121
50-200uL multichannel pipette Denville P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette Denville P3975-9-B
20% formadehyde Tousimis  #1008B
Water Bath ThermoFisher TSCOL35
thermomixer Eppendorf 2231000387 An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator ThermoFisher 13-998-213
Ethanol Sigma Aldrich E7023
Liquid Bleach Fisher Scientific NC9724348
Flowjo 9.8 TreeStar, Inc. Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2 Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer Becton Dikinson
Liquid Bleach Fisher Scientific NC9724348

References

  1. George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
  2. Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  3. Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
  4. Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
  5. Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
  6. Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
  7. Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
  8. Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
  9. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  10. Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
  11. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
  14. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).

Play Video

Cite This Article
Valiant, W. G., Mattapallil, J. J. A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum. J. Vis. Exp. (134), e57371, doi:10.3791/57371 (2018).

View Video