一种基于流式细胞术的简易检测方法 体外 利用寨卡病毒恢复期血清增强登革病毒的抗体依赖性感染

摘要

我们介绍一种简单易行的实验方案，利用登革病毒报告病毒颗粒，通过寨卡病毒感染恢复期血清来检测抗体依赖性增强感染效应。

摘要

抗体依赖性感染增强作用已被证实在中国台湾登革病毒感染致病过程中发挥重要作用。传统检测方法通过检测抗体或血清在非许可性细胞系中增强感染的能力，依赖于培养基中病毒释放量的测定，随后采用蚀斑实验对感染进行定量。近年来，这些检测方法已转为使用荧光标记抗体来检测登革病毒（DENV）在细胞系中的感染情况。然而，上述两种方法均存在局限性，限制了这些技术的广泛应用。本文中，我们描述了一种简便的 体外 使用表达绿色荧光蛋白的登革病毒报告病毒颗粒（RVPs）和K562细胞检测抗体依赖性增强（ADE）的实验方法，血清来源于感染寨卡病毒（ZIKV）16周后的恒河猴。该方法可靠，细胞操作步骤少，无需使用具有复制能力的活病毒，可采用高通量形式进行，并通过流式细胞术获得定量结果。此外，当相应RVPs可用时，该方法可轻松扩展用于检测其他黄病毒属感染（如黄热病毒（YFV）、日本马脑炎病毒（JEEV）、西尼罗病毒（WNV）等）的抗体依赖性增强（ADE）效应。由于实验操作简便、数据分析与结果解读容易，该方法适用于大多数实验室条件。

引言

抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement, ADE）感染是一种由某一病毒血清型诱导产生的部分交叉反应性抗体应答，促进另一种血清型病毒进入细胞的过程，导致病毒复制增加和病毒血症加重。登革病毒（Dengue virus, DENV）感染中已广泛记录了ADE现象，其中存在四种主要的血清型。在部分患者中，ADE与登革出血热（Dengue hemorrhagic fever, DHF）的发生相关。我们近期研究发现，寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）感染可诱导产生显著高水平的DENV交叉反应性抗体应答，从而引发DENV的ADE现象。 体外 并可能促进了登革病毒血症的增强 体内^1,2抗体依赖性增强作用检测是评估抗体增强相关病毒二次感染能力的重要工具，可为黄病毒科病毒感染的致病机制提供有价值的见解，并为疫苗研发提供参考。

本实验所描述的方法利用登革病毒（DENV）报告病毒颗粒（RVPs）以及通常无法被感染的K562细胞。RVPs是结构完整但不具备复制能力的登革病毒颗粒，其携带一个亚基因组的绿色荧光蛋白（GFP）复制子，在经历一轮复制后表达GFP³。因此，被RVPs感染的细胞会发出绿色荧光，可通过流式细胞术或显微镜轻松检测。本实验中使用的RVPs来自....

方案

本方案所用血清样本来自恒河猴，这些动物的饲养和护理均遵循当地、州级和联邦政策，并在国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。所有动物实验均经机构动物护理和使用委员会审查并批准，样本通过组织共享方案获得。

1. 第1天

注意：所有下述步骤均须在生物安全二级（BSL-2）实验室中用于组织培养的无菌层流生物安全柜内进行。

1. 将血清样本在室温下解冻，并将每份血清样本各100 µL转移至无菌管中。在56°C水浴或可调温的恒温混匀仪中加热灭活30分钟。使用冷的RPMI-10培养基（含10%胎牛血清的RPMI）对血清样本进行10倍系列稀释，稀释范围从1:1至1:1,000。
2. 将系列稀释后的血清样本各10 µL加入到无菌96孔V型底板的每个孔中。设置两组对照孔：一组为仅含RPMI-10和RVPs但不含血清样本的孔，另一组为仅含RPMI-10、不含RVPs和血清样本的孔。每份血清样本及RPMI-10对照组均设三个复孔。
3. 从-80°C冰箱中取出登革病毒1、2、3和4型RVPs，在37°C水浴中解冻，并立即将解冻后的RVPs置于冰上。每份血清样本需准备约170 µL RVPs（每个血清稀释度（1:1、1:10、1:100、1:1,000）对应3个孔，每孔10 µL RVPs；仅含RPMI-10和RVPs的对照组每个也需3个孔，每孔10 µL RVPs）。

结果

采集4只恒河猴在感染寨卡病毒（ZIKV）后16周的血清，检测其对登革病毒1、2、3和4型在K562细胞中感染的增强潜力。这些动物在感染后第3天达到病毒血症峰值，血浆中ZIKV RNA拷贝数约为1 × 10⁵ 拷贝/mL，随后病毒载量下降，在感染后7天已低于检测限。在感染后16周时，血浆中未检测到病毒血症。随后按照上述方案进行RVP检测并对收集的数据进行分析。

用于鉴定GFP+细胞的设门策略如图1所示。首先根据FSC-A与FSC-H的关系设定初始门，以排除自发荧光双联体，并仅纳入单细胞。下一个图仅显示来自单细胞门的细胞；在此图中，根据SSC-A与FSC-A的关系设定门，以排除任何自发荧光碎片。这些设门后的细胞随后在第三个图中基于SSC-A与FL1-A的关系进行展示，以鉴定GFP+细胞。被RVP感染的细胞表达GFP，通过围绕这些细胞设定门来确定GFP+细胞的百分比。在寨卡病毒.......

讨论

登革病毒（DENV）和寨卡病毒（ZIKV）在结构蛋白和非结构蛋白方面均存在显著的同源性证据，这些蛋白可诱导产生相互交叉反应的抗体^13,14。研究表明，这些交叉反应性抗体可在体内（in vivo）和体外（in vitro）增强异源血清型或其他相关黄病毒的感染^1,2。这种交叉增强感染的可能性对疾病防控以及疫苗研发具有重要意义。

传统的基于培养的检测方法采用非许可性细胞，在血清存在的情况下用具有感染性的活体登革病毒（DENV）进行感染。通过标准蚀斑检测法定量上清液中的病毒量，以测量感染增强程度¹¹。该检测需要在两种细胞系中培养病毒，且操作耗时较长。此外，并非所有DENV血清型的蚀斑形成方式都相同，这进一步增加了此类检测的复杂性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 细胞	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	RPMI-10 中含 10% FBS
青霉素-链霉素	MP biomedicals	1670049	RPMI-10 中含 100 IU 青霉素/mL，100 µg 链霉素/mL
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	RPMI-10 中含 0.025 M
MEM 非必需氨基酸溶液（100×）	Sigma	M7145	RPMI-10 中使用 1×
丙酮酸钠	Cellegro	25-000-Cl	RPMI-10 中含 1 mM
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	MT25005CI
无菌 V 型底板	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon 聚丙烯 5 mL FACS 管	VWR	60819-728
非无菌 U 型底板	Falcon	Ref 353910	FACS 管的高通量替代方案
5 mL 无菌刻度移液管	Denville	P7127
200 µL 无菌移液器吸头	Denville	P3020 CPS
20 µL 无菌移液器吸头	Denville	P1121
50–200 µL 多通道移液器	Denville	P3975-8-B
5–50 µL 多通道移液器	Denville	P3975-9-B
20% 甲醛	Tousimis	#1008B
水浴锅	ThermoFisher	TSCOL35
恒温混匀仪	Eppendorf	2231000387	用于热灭活的水浴锅替代设备
CO₂ 培养箱	ThermoFisher	13-998-213
乙醇	Sigma Aldrich	E7023
液体漂白剂	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		流式细胞术分析软件
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II 流式细胞仪	Becton Dikinson
液体漂白剂	Fisher Scientific	NC9724348