استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل
Summary
هنا نستخدم الأبعاد شبه يشوه [اغروس] هلام التفريد لتأكيد وجود ألياف اميلويد مثل الحجم غير المتجانسة، واستبعاد إمكانية أن يعود إلى التباين في حجم الانفصال الألياف اميلويد خلال الجل العملية قيد التشغيل.
Abstract
ألياف اميلويد أو اميلويد تشبه ارتبطت بالعديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، والآن يجري اكتشافها مهما للعديد من مسارات الإشارات. القدرة على اكتشاف سهولة تكوين هذه الألياف تحت الظروف التجريبية المختلفة أمر ضروري لفهم وظيفتها المحتملة. وقد استخدمت العديد من الأساليب للكشف عن الألياف، ولكن لا يخلو من بعض العيوب. على سبيل المثال، الميكروسكوب الإلكتروني (م)، أو تلطيخ مع أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين غالباً ما يتطلب تنقية الألياف. من ناحية أخرى، يتيح شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد (SDD-العمر) الكشف عن الألياف اميلويد تشبه المقاوم للحزب الديمقراطي الصربي في مقتطفات الخلية دون تنقية. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يسمح مقارنة الفرق حجم الألياف. الأهم من ذلك، يمكن استخدامه للتعرف على بروتينات محددة داخل الألياف من النشاف الغربية. وأقل استهلاكاً للوقت وأكثر سهولة لعدد أوسع من مختبرات. غالباً ما تظهر النتائج SDD-العمر متغير درجة من عدم التجانس. فإنه يثير المسألة ما إذا كان جزء من التباين النتائج من التفكك للبروتين معقدة أثناء التفريد حضور الحزب الديمقراطي الصربي. لهذا السبب، نحن قد استخدمت بعد ثاني من SDD-سن لتحديد ما إذا كان تباين حجم ينظر في SDD-العمر حقاً نتيجة للألياف عدم التجانس في فيفو وليس نتيجة لتدهور أو تفكك بعض البروتينات خلال التفريد. يسمح هذا الأسلوب تأكيد سريعة ونوعية الألياف اميلويد أو مثل اميلويد هي لا الناي جزئيا خلال عملية SDD-العمر.
Introduction
منذ فترة طويلة كان معروفا تشكيل ألياف اميلويد بسبب البروتين misfolding لتلعب دوراً في ظروف مرضية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، ومرض هنتنغتون1. في الآونة الأخيرة، قد تبين تشكيل ألياف اميلويد أو اميلويد مثل أن تكون جزء من مسارات الإشارات في البشر، بما في ذلك من خلال الاستجابة المناعية الفطرية المضادة للفيروسات2 ونيكروبتوسيس3،4، وفي انخفاض الكائنات الحية مثل الخميرة5،6. ولذلك، من المهم القدرة على الكشف عن هذه الألياف في المعمل. حاليا، هناك ثلاثة طرق رئيسية للكشف عن اميلويد وألياف اميلويد مثل: استخدام الأصباغ، وطب الطوارئ و SDD-العمر.
ويتيح استخدام الأصباغ، مثل أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين، تتميز بأنها سريعة ويمكن كشفها بسهولة باستخدام الفحص المجهري أو التحليل الطيفي7. ومع ذلك، يوفر الكشف عن طريق الفحص المجهري، وفي حالة الكونغو الحمراء، خصوصية لا التي تشمل بروتينات الألياف، أو حجم الألياف. وبالمثل، يوفر استخدام التحليل الطيفي للكشف عن ربط أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين إلى مجمعات البروتين فقط نتيجة إيجابية أو سلبية.
م توفر أدلة قاطعة على وجود الألياف وكمية من المعلومات حول الألياف طولها وقطرها8أيضا. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تنقية صارمة للغاية. بالإضافة إلى ذلك، أم هو أسلوب متخصصة الذي يستخدم معدات باهظة الثمن.
وقد استخدمت SDD-العمر للكشف عن مجمعات البروتين المقاوم للحزب الديمقراطي الصربي دالتون الضخمة بما في ذلك ألياف اميلويد أو مثل اميلويد. ويوفر العديد من المزايا. أولاً، أنها لا تتطلب تنقية الألياف ومن السهل peform9. ثانيا، فإنه يوفر معلومات نوعية عن الحجم الألياف، بما في ذلك الحجم النسبي وكمية من الألياف هيتيروجينيسيتي. وأخيراً، لأنه يمكن أن يؤديها النشاف الغربية بعد التفريد، فمن السهل الكشف عن وجود أي البروتين الذي يوجد جسم، على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أنه نظراً لأن يشوه شبه SDD-العمر، بعض [ابيتوبس] قد تظل أخفى الذي يعقد الكشف بالضد.
في الآونة الأخيرة، أبلغ مستقبلات التفاعل البروتين كيناز 1 (RIPK1) و 3 (RIPK3) على شكل ألياف اميلويد لتكون بمثابة إشارات المنصات خلال نيكروبتوسيس، نموذج مبرمجة من نخر3. أثناء دراسة هذه الألياف، لدينا مختبر أظهرت أن آخر البروتين المرتبطة نيكروبتوسيس، خلط النسب كيناز مثل المجال (ملكل)، وشكلت أيضا ألياف اميلويد مثل4. ومع ذلك، عند الفحص مع SDD-العمر، ظهرت حجم الألياف ملكل متميزة من ألياف RIPK1 و RIPK3، التي بدت متطابقة مع بعضها البعض (الشكل 1). وكان هذا غير متوقع لأنه من المعروف جيدا أن يربط ملكل RIPK1/RIPK3 لتشكيل نيكروبتوسيس إشارة معقدة تسمى نيكروسومي10.
وهناك مالا يقل عن اثنين من التفسيرات. أولاً، قد تشكل ألياف اميلويد تشبه تماما متميزة اثنين أثناء نيكروبتوسيس، واحدة تحتوي على RIPK1/RIPK3 وملكل الأخرى التي تحتوي على. ثانيا، هو نوع واحد فقط من ألياف اميلويد تشبه قد شكلت المحتوية على RIPK1/RIPK3/ملكل أثناء نيكروبتوسيس، ولكن رابطة ملكل مع البروتينات الأخرى ضعف ما يكفي أنه ينأى خلال SDD-العمر.
لمعالجة هذه المشكلة، نقترح إجراء ثنائي الأبعاد (2D) SDD-عمر. وسيكون اميلويد SDD-العمر-مستقرة أو ألياف اميلويد تشبه نفس نمط الهجرة أثناء التفريد البعد الأول والثاني. سيكون هذا الاكتشاف بعد نقل البروتينات إلى غشاء والاضطلاع بوصمة عار غربية. ألياف مستقرة سوف يحمل نقش قطري حادة. أي انحراف عن هذا يوحي بأن الألياف تغيرات بسبب مخزونات النشر الاستراتيجي-التفريد.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجانب الأكثر أهمية في 2D SDD-السن أن شروط التفريد هي نفسها بالنسبة للبعد الأول والثاني. اليكتروفوريسيس القدرة على الكشف عن خط قطري حادة في 45° (التي تشير إلى أن حدوث لا تفكك أو تدهور) يعتمد على الألياف يهاجرون بطريقة مماثلة أثناء على حد سواء. استخدام شروط مختلفة، على سبيل المثال تغيير الجهد أو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل تدعمه زمالة لأدمغة-ألف. من المعاهد الوطنية للصحة/نكتس (TL1TR001104)، منح “مؤسسة ولش” (I-1827)، ومنحة R01 من نيجمس (RGM120502A) إلى Z.W. Z.W. أنور فيرجينيا لينثيكوم الباحث في البحوث الطبية والوقاية من السرطان ومعهد أبحاث من تكساس الباحث (R1222).
Materials
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. . Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
