Summary

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

Published: April 26, 2018
doi:

Summary

כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג’ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג’ל התהליך פועל.

Abstract

סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי קושרו עם מחלות רבות, עכשיו מתגלים להיות חשובה עבור רבים איתות המסלולים. היכולת לזהות בקלות היווצרות של סיבים אלה בתנאים שונים נסיוני חיוני להבנת פונקציית הפוטנציאל שלהם. שיטות רבות השתמשו כדי לזהות את הסיבים, אבל לא בלי מספר חסרונות. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), או צביעת קונגו האדום או Thioflavin T לעיתים קרובות דורשת טיהור של הסיבים. מצד שני, agarose דטרגנט למחצה denaturing בג’ל (SDD-גיל) מאפשרת זיהוי של סיבי עמילואיד דמוי עמידים מרחביות תמציות תא ללא טיהור. בנוסף, הוא מאפשר השוואת ההבדל בגודל של הסיבים. ויותר חשוב, זה יכול לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בתוך הסיבים מאת סופג המערבי. זה פחות זמן רב ונגיש בקלות רבה יותר על מספר רחב של מעבדות. המפגין-גיל התוצאות מציגות לעיתים קרובות משתנה מידת הטרוגניות. זה מעלה את השאלה אם חלק הטרוגניות נובעת הדיסוציאציה של החלבונים במהלך אלקטרופורזה בנוכחות מרחביות. מסיבה זו, יש לנו עובדים ממד השנייה של המפגין-גיל כדי לקבוע אם הטרוגניות גודל ראיתי בעידן-המפגין הוא באמת תוצאה של סיבים הטרוגניות ויוו , לא תוצאה של השפלה או דיסוציאציה של חלק החלבונים במהלך אלקטרופורזה. שיטה זו מאפשרת אישור מהיר, איכותי כי סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי לא בריא באופן חלקי במהלך תהליך המפגין-גיל.

Introduction

היווצרות של סיבי עמילואיד עקב חלבון misfolding יש כבר זמן רב ידוע לשחק תפקיד פיפטות מחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון1. לאחרונה, היווצרות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי הוכח להיות חלק איתות המסלולים בבני אדם, לרבות במהלך התגובה החיסונית מולדת אנטי ויראלית2 ו- necroptosis3,4, ואת היצורים התחתון כגון שמרים5,6. לכן, היכולת לזהות סיבים אלו במעבדה הוא חשוב. כיום, ישנן שלוש דרכים הראשי כדי לזהות עמילואיד ו סיבי עמילואיד כמו: השימוש של צבעי EM, המפגין-גיל.

השימוש של צבעים, כגון קונגו האדום או Thioflavin T, מציעה את היתרון של להיות מהירה בקלות לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ או ספקטרוסקופיה7. עם זאת, זיהוי על ידי מיקרוסקופ, במקרה של קונגו אדום, מספק אין ירידה לפרטים אודותיו חלבונים המרכיבים את הסיבים, או הגודל של הסיבים. בדומה לכך, השימוש של ספקטרוסקופיה לאתר קשירה קונגו אדום או Thioflavin T מתחמי חלבון מספק רק תוצאה חיובית או שלילית.

EM מספקת ראיה חלוטה הנוכחות של סיבים וגם מידע כמותי אודות סיבי האורך ואת קוטר8. עם זאת, שיטה זו דורשת טיהור מחמירים מאוד. בנוסף, EM היא טכניקה מיוחדת אשר משתמשת ציוד יקר.

המפגין-גיל שימש כדי לזהות עמידים מרחביות מגה דלטון חלבון מתחמי לרבות סיבי עמילואיד או דמוי עמילואיד. הוא מציע יתרונות רבים. ראשית, הוא אינו דורש הטיהור של סיבי, הוא קל לעיתים9. שנית, הוא מספק מידע איכותי על הגודל של הסיבים, כולל גודלו היחסי וכמות סיבים heterogenicity. לבסוף, מאחר סופג המערבי יכול להתבצע לאחר אלקטרופורזה, קל לזהות הנוכחות של כל חלבון אשר יש נוגדן, למרות יודגש כי מכיוון המפגין-גיל denaturing למחצה, epitopes מסוימים עשויים להישאר נסתרים אשר מסבך זיהוי על ידי נוגדנים.

לאחרונה, קולטן שמעצבת קינאז 1 (RIPK1) ו- 3 (RIPK3) דווחו על סיבי עמילואיד טופס כדי לשמש איתות פלטפורמות במהלך necroptosis, צורה מתוכנתים של נמק3. תוך כדי לימוד סיבים אלו, המעבדה שלנו הראה כי חלבון אחר הקשורים necroptosis, מעורב שושלת היוחסין קינאז כמו תחום (MLKL), נוצר גם סיבי עמילואיד דמוי4. עם זאת, לאחר בדיקה עם המפגין-גיל, גודל הסיבים MLKL הופיע נבדל הסיבים RIPK1 ו RIPK3, אשר הופיע זהים אחד לשני (איור 1). זה היה לא צפוי כי זה ידוע כי MLKL נקשר RIPK1/RIPK3 כדי ליצור necroptosis באיתות מורכבים שנקרא necrosome10.

ישנם לפחות שני הסברים. ראשית, שני סיבי עמילואיד דמוי שונים לגמרי עלולה להיווצר במהלך necroptosis, אחד המכיל RIPK1/RIPK3, את MLKL המכיל אחרים. שנית, רק סוג אחד של סיבי עמילואיד דמוי שהמכיל RIPK1/RIPK3/MLKL עשוי להיווצר במהלך necroptosis, אבל השיוך של MLKL חלבונים אחרים הוא חלש מספיק. כי זה dissociates במהלך המפגין-גיל.

כדי לטפל בבעיה זו, אנו מציעים מבצע דו מימדי (2D) המפגין-עידן. המפגין-גיל-יציבה עמילואיד או סיבי עמילואיד דמוי יהיה אותו דפוס ההעברה במהלך אלקטרופורזה הממד הראשון והשני. זה יהיה לזיהוי לאחר העברת החלבונים קרום, בביצוע של תספיג חלבון. סיבי יציב תערוכת דפוס אלכסוני חדה. כל סטייה ממנו הייתי מציע כי הסיבים עוברים שינויים עקב מרחביות-אלקטרופורזה.

Protocol

1. מכינים דגימות תרבות 2 x 106 עמילואיד לייצר תאים סרטניים של המעי הגס HT-29 בקערה תרביות רקמה ס מ-10 ב- 10 מ”ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) המכילה 10% סרום שור בעובר ו פניצילין-סטרפטומיצין. התרבות התאים לינה חממה 37 ° C עם 5% CO2. לאחר התאים גדלים כדי 80% confluency, לשטוף את התאים עם 10 מ ל תמי…

Representative Results

לאחר אינדוקציה necroptosis, RIPK1 ו- RIPK3 הראו כמעט זהה עמילואיד דוגמאות (נתיבים 2 ו- 4, איור 1). עם זאת, סיבי MLKL היו הטרוגנית יותר ודומה להיות קטן יותר סיבים RIPK1/RIPK3 (ליין 6, איור 1). שהביאה אותנו לפתח שיטת המפגין-גיל 2D להתייחס לאפשרות MLKL טפסים סיבי RIPK1/RIPK3-עצ…

Discussion

הפן הקריטי ביותר של המפגין 2D-הגיל הוא כי התנאים אלקטרופורזה זהים עבור הממד הראשון והשני. היכולת לזהות קו אלכסוני חדה ב- 45 מעלות (המציין שהתרחשה אין דיסוציאציה או השפלה) תלוי הסיבים מעביר בצורה זהה במהלך שני electrophoreses. שימוש בתנאים שונים, לדוגמה שינוי המתח או את משך זמן ריצה, מטשטש את התוצאות ה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי התחברות עבור תרגום-א מ- NIH/NCATS (TL1TR001104), קרן Welch הענק (I-1827), מענק R01 של NIGMS (RGM120502A) ל ז. ו. ז. ו. המלומד קמפ ספרינגס מורצ’יסון וירג’יניה מחקר רפואי, מניעת סרטן, מכון המחקר של טקסס מלומד (R1222).

Materials

gel electrophoresis unit Fisher HE99XPRO appratus for gel running.
agrose VWR 97062-250 For agarose gel.
paper tower Fisher 19-120-2484 for transfering
filter paper VWR 21427-386 for transfering
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177 for transfering
blocking milk powder Bio-Rad 1706404XTU for blocking in Western blot
MLKL antibody Genetex GTX107538 rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody BD Biosciences 610459 mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody gift from Dr. Xiaodong Wang rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP Sigma A6154 secondary antibody
ECL Fisher WBKLS0500 Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film Fisher F-BX810 for Western blot result
DMEM Sigma D6429 for cell culture
fetal bovine serum Sigma F4135 for cell culture
penicilin-streptomycin Sigma P4333 for cell culture
Trypsin solution Sigma T4049 for cell culture
PBS for tissue culture Sigma D8662 for cell culture
recombinant TNF made in our lab for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic gift from Dr. Xiaodong Wang for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK ApexBio A1902 for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter Bio-Rad 1450102 Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter Fisher 07-200-364 to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L) 20 mL 1 M Tris pH 7.4
10 mL glycerol
30 mL 5 M NaCl
840 mL ddH2O
10 mL Triton-X100
(protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L) 48.4 g Tris base
11.42 mL glacial acetic acid
20 mL 0.5M EDTA pH 8
ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) 5 mL 10X TAE
10 mL glycerol
4 mL 20% SDS
0.5 mL 10% bromophenol blue
31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L) 20 mL 1 M Tris pH 7.4
30 mL 5 M NaCl
950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L) 100 mL 10xPBS
800 mL ddH2O
1 mL Tween20
10X PBS (10 L) 800 g NaCl
20 g KCl
144 g Na2HPO4·2H2O
24 g KH2PO4
add ddH2O to 10 L

References

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  3. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  4. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
  5. Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
  6. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
  7. Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
  8. Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
  9. Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. . Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
  10. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  11. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).

Play Video

Cite This Article
Hanna-Addams, S., Wang, Z. Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers. J. Vis. Exp. (134), e57498, doi:10.3791/57498 (2018).

View Video