Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels
Summary
Hier gebruiken we de Elektroforese van het gel van de tweedimensionale semi-denatureren agarose bevestigen de aanwezigheid van amyloid-achtige vezels van heterogene grootte en uitsluiten van de mogelijkheid dat de heterogeniteit van grootte te wijten aan de dissociatie van de amyloïde vezels tijdens de gel is lopend proces.
Abstract
Amyloïde of amyloid-achtige vezels zijn geassocieerd met vele ziekten bij de mens, en zijn nu belangrijk voor vele signaalroutes wordt ontdekt. De mogelijkheid om de vorming van deze vezels onder verschillende experimentele omstandigheden gemakkelijk te detecteren is van essentieel belang voor het begrijpen van hun potentiële functie. Veel methoden zijn gebruikt voor het detecteren van de vezels, maar niet zonder nadelen. Elektronenmicroscopie (EM) of kleuring met Congo rood of Thioflavin T vaak wordt bijvoorbeeld vereist dat de zuivering van de vezels. Aan de andere kant, maakt semi-denatureren wasmiddel agarose gelelektroforese (SDD-leeftijd) de ontdekking van de SDS-resistente amyloid-achtige vezels in de cel extracten zonder zuivering. Bovendien, staat het de vergelijking van het verschil van de grootte van de vezels. Wat nog belangrijker is, kan het worden gebruikt om te identificeren specifieke proteïnen binnen de vezels door het westelijke bevlekken. Het is minder tijdrovend en meer gemakkelijk toegankelijk is voor een groter aantal labs. Resultaten van de SDD-leeftijd blijkt vaak variabele mate van heterogeniteit. Het doet de vraag rijzen of het deel van de heterogeniteit voortvloeit uit de dissociatie van het eiwit complex tijdens de elektroforese in aanwezigheid van SDS. Om deze reden hebben we een tweede dimensie van de SDD-leeftijd om te bepalen als de heterogeniteit van de grootte gezien in SDD-leeftijd echt een resultaat van vezel heterogeniteit in vivo en niet een gevolg van afbraak of dissociatie van een aantal van de eiwitten tijdens is dienst elektroforese. Met deze methode kunt snelle en kwalitatieve bevestiging dat de amyloïde of amyloid-achtige vezels niet gedeeltelijk tijdens het proces van de SDD-leeftijd distantieert zijn.
Introduction
De vorming van amyloïde vezels te wijten aan het eiwit misfolding is al lang bekend een rol te spelen in de pathologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington1. Meer recentelijk, de vorming van amyloïde of amyloid-achtige vezels is gebleken om een deel van signaalroutes bij de mens, met inbegrip van tijdens anti-virale ingeboren immune reactie2 en necroptosis3,4, en in lagere organismen zoals gist5,6. De mogelijkheid om op te sporen van deze vezels in het lab is daarom belangrijk. Momenteel zijn er drie belangrijke manieren om amyloid en amyloid-achtige vezels te detecteren: het gebruik van kleurstoffen, EM en SDD-leeftijd.
Het gebruik van kleurstoffen, zoals Congo rood of Thioflavin T, biedt het voordeel dat ze snel en gemakkelijk aantoonbaar met behulp van microscopie of spectroscopie7. Detectie door microscopie, in het geval van Congo rood, biedt echter geen specificiteit waarover eiwitten bestaan uit de vezels, of de grootte van de vezels. Ook biedt het gebruik van de spectroscopie te detecteren Congo rood of Thioflavin T binding aan eiwitcomplexen alleen een positief of negatief resultaat.
EM biedt sluitend bewijs van de aanwezigheid van vezels en ook kwantitatieve informatie over de vezel lengte en diameter8. Deze methode vereist echter zeer strenge zuivering. Bovendien, is EM een gespecialiseerde techniek die gebruik maakt van dure apparatuur.
SDD-leeftijd is gebruikt voor het detecteren van SDS-resistente mega Dalton eiwitcomplexen met inbegrip van amyloïde of amyloid-achtige vezels. Het biedt vele voordelen. Ten eerste, het is niet vereist voor de zuivering van de vezels en is gemakkelijk te peform9. Ten tweede, het biedt kwalitatieve informatie over de grootte van de vezels, met inbegrip van de relatieve grootte en hoeveelheid van de vezel heterogenicity. Ten slotte, omdat het westelijke bevlekken kan worden uitgevoerd na elektroforese, het is gemakkelijk om het detecteren van de aanwezigheid van een eiwit waarvoor er een antilichaam is, hoewel hierbij moet worden opgemerkt dat omdat SDD-leeftijd semi-denatureren is, sommige epitopes verborgen die blijven kunnen compliceert detectie door antilichaam.
Onlangs, receptor interactie proteïne kinase 1 (RIPK1) en 3 (RIPK3) gemeld aan formulier amyloïde vezels om te dienen als signalering platformen tijdens necroptosis, een geprogrammeerde vorm van necrose3. Terwijl het bestuderen van deze vezels, toonde ons lab dat een ander necroptosis-geassocieerde proteïne, gemengde afkomst kinase domein-achtige (MLKL), ook amyloid-achtige vezels4gevormd. Echter, bij onderzoek met de SDD-leeftijd, de grootte van de vezels MLKL verscheen onderscheiden van de RIPK1 en RIPK3 vezels, die leek identiek aan elkaar (Figuur 1). Dit was onverwacht omdat het is bekend dat MLKL aan RIPK1/RIPK3 bindt om te vormen de necroptosis signalering complex genaamd de necrosome10.
Er zijn ten minste twee verklaringen. Ten eerste, twee totaal verschillende amyloid-achtige vezels kunnen vormen tijdens de necroptosis, een met RIPK1/RIPK3 en de andere met MLKL. Ten tweede, is slechts één type van amyloid-achtige vezels die met RIPK1/RIPK3/MLKL kan worden gevormd tijdens de necroptosis, maar de associatie van MLKL met de andere eiwitten zwak genoeg dat het distantieert tijdens SDD-leeftijd.
Om aan te pakken dit, stellen wij voor het uitvoeren van een tweedimensionale (2D) SDD-leeftijd. SDD-leeftijd-stable amyloid of amyloid-achtige vezels zal hetzelfde patroon migratie hebben tijdens de eerste en de tweede dimensie elektroforese. Dit is aantoonbaar zijn na overdracht van de eiwitten naar een membraan en het uitvoeren van een westelijke vlek. Stabiele vezels zal een scherpe diagonaal patroon vertonen. Elke afwijking hiervan zou suggereren dat de vezels ondergaan veranderingen als gevolg van de SDS-elektroforese.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische aspect van de 2D SDD-leeftijd is dat de voorwaarden van de elektroforese hetzelfde voor de eerste en tweede dimensie zijn. De capaciteit om te ontdekken een scherpe diagonale lijn van 45 ° (hetgeen aangeeft dat geen dissociatie of aantasting heeft plaatsgevonden) hangt af van de vezels die migreren op identieke wijze tijdens beide electrophoreses. Met behulp van verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld het wijzigen van de spanning of de lengte van de runtime zal het verdoezelen van deze resultaten. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door een fellowship voor S.H.-A. NIH-/ NCATS (TL1TR001104), een stichting Welch verlenen (I-1827) en een subsidie van de R01 van NIGMS (RGM120502A) voor Z.W. Z.W. is de Virginia Murchison Linthicum geleerde in medisch onderzoek en preventie van kanker en onderzoek instituut van Texas geleerde (R1222).
Materials
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. . Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
