שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.
Abstract
ראשי keratinocytes האנושי מבודד רקמות עור רענן, שלהם הרחבה במבחנה היה בשימוש נרחב עבור מחקר מעבדתי, יישומים קליניים. השיטה המקובלת בידוד keratinocytes האנושי כרוך הליך רציפים עיכול אנזימטי בן שני שלבים, אשר הוכח להיות יעיל ליצירת תאים העיקרי של רקמות בוגרות עקב קצב התאוששות התאים נמוך תא מופחת הכדאיות. לאחרונה דיווחנו שיטה מתקדמת כדי לבודד אנושי ראשוני עוריות ובתאים של רקמות העור אשר מנצל את מעכבי קינאז רו Y-27632 בטווח הבינוני. בהשוואה עם פרוטוקול מסורתיים, שיטה חדשה הוא יותר פשוט, קל יותר, פחות זמן רב, ו מגביר תאי אפיתל התשואה ומגבירה את המאפיינים תאי הגזע שלהם. יתר על כן, המתודולוגיה החדשה אינה דורשת את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, ומתאים, לכן, לבודד תאים מסוגים שונים של רקמות בוגרות. שיטה חדשה זו בידוד מתגבר את החסרונות העיקריים של שיטות קונבנציונליות, והוא מתאים יותר לייצר מספר גדול של תאים באפידרמיס עם האון גבוהה הן במעבדה והן עבור יישומים קליניים. כאן, אנו מתארים את השיטה החדשה בפירוט.
Introduction
המטרה הייתה לפתח פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לבודד keratinocytes אנושי ראשוני (HKCs) של רקמות בוגרות, במיוחד עבור יישומים קליניים. תאי גזע עוריות העור, מותאם לשכבת הבסיס של העור, בעלי פוטנציאל גבוה כדי להתרבות, להבדיל ולספק keratinocytes כדי לשמור על הפונקציות של העור1,2,3, 4. HKCs מבודד מן העור רקמות נמצאים בשימוש נרחב למטרות בעור רקמות הנדסה והתחדשות, במיוחד בתיקון של עור פגוע, ריפוי גנטי עבור יישומים קליניים5,6. הנושא המרכזי עבור יישומים מבוססי-HKC הוא ביעילות לבודד ולהרחיב מספרים גדולים של HKCs עם גבוהה פוטנציאל במבחנה7,8. למרות קבוצות מחקר שונות פיתחו שיטות כדי לייצר תרבויות של גזע דמוי HKCs, שיטות אלה הם לעיתים זמן רב ומורכב לבצע ויש מגבלות אחרות, כגון תא נמוך התשואות מוגבלים לפי סוג העור הדגימה שימוש9. למשל, השיטה המסורתית כדי לבודד HKCs רקמות העור כרוך עיכול אנזימטי של שני שלבים עם הפרדה של האפידרמיס הדרמיס6. בשיטה זו בדרך כלל עובד טוב בשביל לרקמות neonatal, אבל זה הופך להיות קשה מאוד, כאשר נעשה שימוש כדי לבודד תאים של רקמות בוגרות.
Y-27632, מעכב של רו-הקשורים חלבון (רוק), דווח לשפר באופן משמעותי את היעילות של תאי אפידרמיס בידוד והמושבה הצמיחה10,11,12. במחקר הקודם, גילינו כי Y-27632 מקלה על צמיחת תאים אפידרמיס המשובטים אך מפחית את התשואה של עורי תאים על-ידי שליטה באופן שונה את הביטוי של מולקולות אדהזיה13. הקמנו גם מדיום ממוזגים חיסון חדש, בשם G-בינוני, אשר תומך את הצמיחה ואת התשואה של ראשי תאים באפידרמיס. על ידי שילוב G-בינוני עם Y-27632, שיטה חדשנית זו יכול באופן ספונטני נפרד תאים באפידרמיס עורי לאחר אנזים עיכול, ובכך להסיר את השלב של האפידרמיס-הדרמיס ההפרדה13,14. על סמך דיווחים קודמים, נתאר עכשיו ההליך מפורט של שיטה חדשה כדי לבודד HKCs של רקמת עור מבוגר.
Protocol
Representative Results
Discussion
בתרבית HKCs העיקרי היה להיות מנוצל באופן נרחב לטיפול פצעי במרפאות במשך יותר משלושה עשורים, מאז, זה היה תמיד חשוב ביעילות להשיג מספר מספיק של תאים עבור יישומים קליניים מבעוד. לפיכך, בפועל, השיטה המקובלת בידוד, הדורש את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, מקשה לעמוד בדרישות אלה, בשל התשואה נמוכה של התא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המחקר מפתח הלאומי ועל פיתוח תוכנית של סין (2017YFA0104604), התוכנית הכללית של נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (NSFC, 81772093), מדע, טכנולוגיה פיתוח תוכנית של סאזהאו (ZXL2015128), את מדעי הטבע קרן של מחוז ג’יאנגסו (BK20161241), ופרס של שאנדונג טאישאן מלומד (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells – role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
