Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.
Abstract
Primários queratinócitos humanos isolados dos tecidos da pele fresca e sua expansão em vitro foram amplamente utilizados para pesquisas de laboratório e para aplicações clínicas. O método de isolamento convencional de queratinócitos humanos envolve um procedimento em duas fases sequenciais de digestão enzimática, que tem sido provado ser ineficiente na geração de células primárias de tecidos adultos devido à taxa de recuperação de baixo da célula e célula reduzida viabilidade. Nós recentemente relatou um método avançado para isolar humano primário epidérmico progenitoras de tecidos de pele que utiliza o inibidor de quinase Rho Y-27632 no meio. Comparado com o protocolo tradicional, este novo método é mais simples, mais fácil e menos demorado e aumenta o rendimento de células-tronco epiteliais e melhora suas características de células-tronco. Além disso, a nova metodologia não exige a separação da epiderme da derme e, portanto, é apropriada para isolar células de diferentes tipos de tecidos adultos. Este novo método de isolamento supera as principais deficiências dos métodos convencionais e é mais apropriado para produzir um grande número de células epidérmicas com alta potência para laboratório e para aplicações clínicas. Aqui, descrevemos o novo método em detalhe.
Introduction
O objetivo foi desenvolver um protocolo simples e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários (HKCs) de tecidos adultos, especialmente para aplicações clínicas. Células-tronco epidérmicas da pele, localizadas na camada basal da pele, possuem um alto potencial para proliferar e diferenciar e fornecer queratinócitos para manter as funções da pele1,2,3, 4. HKCs isoladas de pele, tecidos são amplamente utilizados para pele tecido engenharia e regeneração, especialmente na reparação da pele danificada e em terapia gênica para aplicações clínicas5,6. A questão-chave para aplicativos baseados em HKC é eficientemente isolar e expandir um grande número de HKCs com alto potencial em vitro7,8. Apesar de vários grupos de pesquisa, desenvolveram métodos para produzir culturas de haste-como HKCs, esses métodos são, por vezes, demorado e complicado para realizar e tem outras limitações, tais como a célula de baixo rendimento e sendo limitada pelo tipo de amostra de pele usado9. Por exemplo, o método tradicional para isolar a HKCs dos tecidos da pele envolve uma digestão enzimática em duas fases, com uma separação da epiderme da derme6. Esse método geralmente funciona bem para tecidos neonatais, mas torna-se muito difícil quando usado para isolar as células de tecidos adultos.
Y-27632, um inibidor de Rho-associada a proteína quinase (ROCK), tem sido relatado para melhorar significativamente a eficiência das células-tronco epidérmicas isolamento e colônia crescimento10,11,12. Em um estudo anterior, descobrimos que Y-27632 facilita o crescimento clonal das células epidérmicas, mas reduz o rendimento das células dérmicas controlando diferencialmente a expressão de moléculas de adesão13. Também estabelecemos um novo meio de inoculação condicionados, chamado G-médio, que suporta o crescimento e a produtividade das células epidérmicas primárias. Combinando G-médio com Y-27632, este novo método pode espontaneamente separar células epidérmicas e dérmicas após digestão enzimática, eliminando assim a etapa da epiderme-derme separação13,14. Agora com base em relatórios anteriores, descrevemos o procedimento detalhado deste novo método para isolar HKCs do tecido da pele adulta.
Protocol
Representative Results
Discussion
HKCs primárias cultivadas têm sido amplamente utilizados para tratar feridas em clínicas por mais de três décadas e, desde então, tem sido sempre importante eficientemente obter um número suficiente de células para aplicações clínicas em tempo hábil. Portanto, na prática, o método de isolamento convencional, o que exige a separação da epiderme da derme, torna difícil atender a essas demandas, devido o baixo rendimento das células e a baixa capacidade de passagem de células adultas. Aqui, descrevemos um…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo nacional chave de pesquisa e desenvolvimento programa de China (2017YFA0104604), o programa geral da Fundação Nacional de ciências naturais da China (NSFC, 81772093), a ciência e tecnologia programa de desenvolvimento de Suzhou (ZXL2015128), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (BK20161241) e um prêmio de estudioso de Taishan de Shandong (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
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