성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Summary

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

Abstract

기본 인간 keratinocytes 신선한 피부 조직 및 그들의 확장에서 에 체 외에서 고립 된 실험실 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 인간의 keratinocytes의 기존의 격리 방법은 포함 한다 낮은 세포 회복 율 및 감소 셀 성인 조직에서 1 차 셀을 생성 효율적으로 입증 된 2 단계 순차 효소 소화 절차를 생존 능력입니다. 우리는 최근 매체에 노 키 니 아 제 억제 물 Y-27632를 활용 하 여 피부 조직에서 인간의 기본 상피 조상 세포 분리 고급 방법 보고. 전통적인 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 간단 하 게, 쉽게, 그리고 보다 적게 시간이 걸리는, 그리고 상피 줄기 세포 수확량 증가 이며 그들의 줄기 세포 특성을 향상 시킵니다. 또한, 새로운 방법론, 진 피에서 표 피의 분리는 필요 하지 않습니다 이며, 따라서 여러 유형의 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 적합 한. 이 새로운 격리 방법 기존 방법의 주요 단점을 극복 하 고 높은 힘 실험실 및 임상 응용 프로그램에 대 한 많은 수 표 피 세포의 생산에 대 한 더 적합 합니다. 여기, 우리가 새로운 방법을 자세히 설명합니다.

Introduction

목표 임상 응용 성인 조직에서 기본 인간의 keratinocytes (HKCs)을 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발 했다. 피부의 기저 층에 피부 표 피 줄기 세포 증식 및 분화 keratinocytes 피부^1,2,3, 의 기능을 유지 하기 위해 제공 하는 높은 잠재력을가지고 ⁴. HKCs 피부 조직 목적을 위해 피부 조직 공학 및 재생, 특히 손상 된 피부의 복구와 임상 응용 프로그램^5,6에 대 한 유전자 치료에 널리 이용 된다에서 격리. HKC-기반 응용 프로그램에 대 한 중요 한 문제는 파악 하 고 확장 하는 높은 잠재적인 생체 외에서^7,8HKCs의 큰 숫자입니다. 다양 한 연구 그룹 줄기 같은 HKCs의 문화를 생산 하는 방법을 개발 했습니다, 하지만 이러한 방법을 수행 하 고 낮은 셀 수율 등 피부 견본 형식에 의해 제한 되 고 다른 제한이 복잡 하 고 시간이 많이 소요 되기도 ⁹를 사용합니다. 예를 들어, 피부 조직에서 HKCs을 전통적인 방법은 진 피⁶에서 표 피의 분리 2 단계 효소 소화를 포함 한다. 그 방법은 일반적으로 신생아 조직을 위해 잘 작동 하지만 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 사용 하는 경우 그것은 매우 어려워집니다.

Y-27632, 억제제로 관련 단백질 키 니 아 제 (바위)의 표 피 줄기 세포 격리와 식민지 성장^10,,1112의 효율성을 크게 향상을 보고 되었습니다. 이전 연구에서 우리는 Y-27632 상피 세포의 클론 성장을 촉진 하지만 차동 접착 분자¹³의 식을 조절 하 여 피부 세포의 수확량 감소를 발견 했다. 우리는 또한 성장과 기본 표 피 세포의 수익률을 지 원하는 G-매체 라는 새로운 조건된 접종 매체 설립. G-매체 Y-27632와 결합 하 여이 새로운 메서드는 표 피-진 피 분리^13,14단계 제거 효소 소화 후 저절로 피 및 피부 세포를 분리할 수 있습니다. 이전 보고서를 바탕으로, 우리는 지금 성인 피부 조직에서 HKCs을이 새로운 방법의 상세한 절차를 설명 합니다.

Protocol

이 프로토콜에서 사용 하는 인간의 조직 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침에 따라 처리 된 (NO.2015120401, 날짜: 2015 년 5 월 12 일). 1입니다. 준비 얼음 처럼 차가운 Dulbecco의 10 mL 50 mL 튜브에 병원에서 성형 수술에서 삭제 수집 신선한 성인 복 부 피부 조직이 글 중간 (DMEM)으로. 표본은 세포 생존 능력에 크게 영향을 주지 않고 최대 72 h 4 ° C에서 보관할 수 있습니다. …

Representative Results

새 메서드 (그림 1A)와 기존의 방법 (그림 1B)의 도식 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 기존의 방법은 2 일 절차는 2 단계 소화 합니다. 대조적으로, 새로운 방법은 작업에 약 3 시간 소요 단계 소화 합니다. 중요 한 것은, 한 단계 새로운 방법 접종 매체에 Y-27632의 존재에 달려 있는 동시에 두 개의 인구 (표…

Discussion

상처를 치료 클리닉에서 3 년 이상에 대 한 교양된 기본 HKCs 널리 이용 되었습니다 그리고, 그때 이후로, 그것은 항상 중요 했다 효율적으로 적시에 임상 응용 프로그램에 대 한 셀의 충분 한 번호를 얻을. 따라서, 실제로 기존의 절연 메서드와, 진 피에서 표 피 분리, 어렵게 셀과 낮은 수 성인 셀 통로의 낮은 수율으로 인해 이러한 요구 사항을 충족 합니다. 여기, 우리는 우리가 효율적으로 연구소 …

Materials

Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
Electronic Scale	Harbin Zhonghui	1171193	For tissue weighing
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
50ml Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For HKC dissociation
0.25% Trypsin	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	For HKC dissociation
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	For coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	For HKC isolation
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	For HKC isolation
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams	Life Technologies	31765035	Component of G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Growth factor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK inhibitor
Fungizone	Gibco	15290026	Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis