采用高分辨率基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）结合单核苷酸延伸策略，建立了一种无需标记和放射性同位素的DNA聚合酶校对及DNA修复检测方法。该检测方法在检测长度短于9个核苷酸的校对和修复片段时，表现出高度特异性、操作简便、快速且易于实施的特点。
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方法文章
使用单核苷酸延伸与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析进行校对与DNA修复检测
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
基因组的维持及其精确复制对于遗传信息的保存至关重要。为了评估高保真复制，我们开发了一种简单、无标记且非放射性同位素的方法，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析，用于校对功能的研究。此处，使用一种DNA聚合酶［例如， 大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段（KF） 大肠杆菌 本研究中使用DNA聚合酶I（pol I）在存在四种双脱氧核糖核苷三磷酸的条件下处理错配的引物-模板双链。随后对该错配引物进行校读/延伸，并进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。通过引物质量的变化，可区分出单核苷酸水平的差异。重要的是，该方法也可用于检测内部单个错配的校读，尽管其效率有所不同。位于引物3'端2–4个核苷酸（nt）处的错配可被pol I高效校读，而位于5 nt处的错配仅表现出部分校正。对于位于引物3'端6–9 nt处的内部错配，则未观察到校读现象。该方法亦可应用于DNA修复检测分析。例如， 评估内切酶V修复途径底物的碱基损伤修复。含有3'倒数第二个脱氧肌苷（dI）损伤的引物可被pol I修复。事实上，pol I能够切除倒数第二个T-I、G-I和A-I底物中最后两个含dI的核苷酸，随后加入正确的ddN 5'-单磷酸（ddNMP）；而倒数第二个C-I错配则被pol I耐受，使引物在未修复的情况下得以延伸，从而证明了质谱分析法在检测DNA修复时具有高灵敏度和分辨能力。
引言
DNA聚合酶在DNA复制过程中的校对功能对于确保遗传信息高保真地传递给子代至关重要1,2,3,4,5,6,7。能够评估聚合酶校对外切核酸酶的贡献，将有助于阐明维持遗传稳定性的机制。
放射性同位素标记结合基于凝胶的检测方法，以及对放射自显影图像或磷屏成像进行的密度测定分析8,9,10 传统上，检测DNA聚合酶的校对活性一直采用此类方法。尽管这些方法具有功能可行性，但操作繁琐、成本高昂，且难以适用于高通量实验模式。此外，放射性同位素的使用存在安全问题，包括放射性废物的处理。作为替代方案，已有研究采用荧光检测技术分析校对活性。例如，2-氨基嘌呤（2-AP）可在延伸产物合成过程中被掺入 体外 聚合酶校对活性检测以产生荧光信....
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方案
1. 引物/模板制备
- 设计引物/模板时，G+C含量应平衡，保持在40%至60%之间，如同测序或PCR引物设计。使用18至21个核苷酸长度的引物，以获得适当的退火效果和更佳的质谱信号。
- 设计模板时，双链区的最低熔解温度设为50 °C，并确保具有至少7个核苷酸的5'-突出端，以分离引物与模板之间的信号。
注意：例如，在表1中的底物P21/T28，21-nt引物与28-nt模板配对。可选方案：可使用如核酸酶抗性的硫代磷酸酯键替代模板3'端最后4个磷酸二酯键，以防止模板可能发生非特异性3'端降解（例如，表1中的T28S4），尽管这将增加模板制备的部分成本。 - 本研究中使用标准脱盐寡核苷酸且无需进一步纯化即可满足要求。将寡核苷酸引物/模板配制成100 pmol/µL的H2O溶液作为储备液，并于-20 °C保存。通过MALDI-TOF质谱分析（步骤4–7）检测引物和模板的质量与纯度，确保其具有单一峰信号及良好的信噪比。
- 测定反应中相关序列等摩尔引物的相对MALDI-TOF质谱信号强度（步骤7），用于校准和浓度归一化（图2）。
2. 校对反应
注意：相同的校对反应条....
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结果
模板与引物：
采用本方案，对从商业来源获得的等摩尔合成寡核苷酸模板和相应序列引物进行了纯度和质量检测（图 3A；注意信号与指定质量相符且背景信号较低），同时也检测了峰强度与分析物质量之间的关系（图 2A）。对质谱数据的峰高进行了测量和计算（图 2B），以进行归一化处理。
反应条件和质谱：
已有研究证明，将单碱基引物延伸反应与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-.......
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讨论
本研究描述了一种使用 MALDI-TOF 质谱法，通过选定的商用仪器（参见材料表）进行逐步分析的校对活性检测方法。该方法的主要优点在于引物和模板无需标记且操作简便，从而在实验设计上具有更高的灵活性。对30个校对测试进行流水线式完整处理需要4小时，其中包括3小时的人工完成校对反应及其纯化步骤，而使用上述方案的 MALDI-TOF 质谱分析则需1小时完成。该方法的主要缺点是检测所需的底物用量较大。为了获得强信号和一致的结果，我们在20 µL反应体系中使用了50 pmol的DNA底物；因此，DNA用量远高于放射性标记DNA实验8,9,10。通过减小反应体积和样品量，并对质谱操作进行精细优化，可降低所需底物的用量。
从商业来源获得的合成寡核苷酸可直接用于校对研究，无需进一步纯化或处理。然而，建议通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测DNA的纯.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢中国台湾台北市国家核心设施平台功能基因组学整合核心设施和中国台湾台北市国家研究促进生物医学药物基因组学实验室提供的技术支持。本研究工作得到了台湾健康基金会（L-I.L.）以及中国台湾台北市科技部 [MOST 105-2320-B-002-047] 对方维鸿（Woei-horng Fang）的支持，[MOST 105-2628-B-002 -051-MY3] 对苏康毅（Kang-Yi Su）的支持，以及 [MOST-105-2320-B-002-051-MY3] 对林亮印（Liang-In Lin）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 寡核苷酸 | Mission Biotech (中国台湾) | ||
| 硫代磷酸酯修饰寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies (中国台湾) | ||
| DNA聚合酶I大片段（Klenow片段） | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow片段（3'→5' exo-） | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP、dGTP、dCTP、dTTP混合物 | Clubio, 中国台湾 | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP芯片阵列 | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0软件 | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin工具试剂盒 | Agena Bioscience, CA | #08040 |
参考文献
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA....
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重印与许可
