Correction d’épreuves et de test de réparation d’ADN en utilisant l’analyse de spectrométrie de masse MALDI-TOF et de nucléotide simple Extension
Summary
Une méthode non marqué, non-radio-isotopiques pour la relecture de l’ADN polymérase et un test de réparation de l’ADN a été développée à l’aide de haute résolution spectrométrie de masse MALDI-TOF et une stratégie d’extension de nucléotide. Le test s’est avéré être très précis, simple, rapide et facile à réaliser pour la relecture et réparer les correctifs inférieure à 9-nucléotides.
Abstract
Le maintien du génome et sa reproduction fidèle est primordial pour la conservation des données génétiques. Pour évaluer la réplication haute fidélité, nous avons mis au point un simple non marqué et méthode non-radio-isotopique avec une désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) temps de vol de masse analyse de spectrométrie (SM) pour une étude de relecture. Ici, une ADN polymérase [par exemple, le fragment de Klenow d’ADN polymérase d’Escherichia coli (KF) j’ai (pol je) dans cette étude] en présence de tous les quatre dideoxyribonucleotide triphosphates est utilisé pour traiter un duplex modèle primer ne correspondent pas. L’apprêt ne correspondent pas est puis relire/étendu et soumis à MALDI-TOF MS. Les produits sont distinguent par la variation de la masse du primaire vers le bas pour des variations nucléotidiques. Ce qui est important, une relecture peut aussi être déterminé pour inadéquation unique interne, quoiqu’à des rendements différents. Incompatibilités situées à 2-4-nucléotides (nt) de l’extrémité 3′ ont été efficacement corrigé par pol I et une incompatibilité à 5 nt depuis le terminus de l’apprêt a montré seulement une correction partielle. Aucune relecture s’est produite pour les non-correspondances internes situés au 6-9 nt de l’extrémité 3′ apprêt. Cette méthode peut également être appliquée aux dosages de réparation d’ADN (par exemple, évaluer une réparation de base-lésion de substrats pour la voie de réparation endo V). Amorces contenant 3′ avant-dernier désoxyinosine (dI) lésions pourraient être corrigées par pol j’ai. En effet, avant-dernier T-I, G-I et A-j’ai les substrats présentaient leurs derniers 2 nucléotides contenant dI excisés par pol I avant d’ajouter un ddN correct 5′-monophosphate (ddNMP) tout en avant-dernière C-j’ai incompatibilités ont été tolérées par pol I, ce qui permet l’amorce d’étendre sans réparation, démontrant que la sensibilité et la résolution de la MS d’analyse permettant de mesurer la réparation de l’ADN.
Introduction
Les fonctions de relecture des polymérases d’ADN au cours de la réplication de l’ADN sont essentielles pour garantir la haute fidélité de l’information génétique qui doit être transférée aux descendants1,2,3,4, 5,6,7. Être en mesure d’évaluer les contributions de la polymérase relecture exonucleases préciserait les mécanismes de sauvegarde de la stabilité génétique.
Radio-isotope étiquetage et gel à base de tests en combinaison avec des analyses densitométriques des autoradiogrammes ou phosphore d’imagerie8,9,10 ont traditionnellement été utilisées pour détecter les activités de relecture de l’ADN polymérases. Bien que fonctionnel, ces tests sont laborieux et coûteux ne se prêtent pas à des formats de haut débit. En outre, radio-isotopes souffrent de problèmes de sécurité, y compris l’élimination des déchets. Alternativement, relecture des activités ont été analysées par des techniques de dosage fluorimétrique. Par exemple, 2-aminopurine (2-AP) peut être incorporé dans les produits d’extension au cours de la polymérisation in vitro en relecture d’épreuves pour produire un signal fluorescent11,12. Malheureusement, ces approches souffrent d’une faible spécificité, puisque 2-AP peut appairer avec thymine et cytosine. Des approches plus récentes incluent une base G-quadruplexe luminescente marche sonde sensible pour une polymérase 3′ – 5′ exonucléase dosage13 ainsi qu’une sonde fluorescente marquée individuellement pour une polymérase relecture analyse qui surmonte certaines de la les inconvénients susmentionnés14. L’enthousiasme pour ces méthodes fluorimétrique est diminuée en raison de la nécessité pour l’étiquetage précis de substrats de l’ADN.
En revanche, une MALDI-TOF-MS pour l’analyse de l’ADN a été utilisée dans l’essai de PinPoint, où les réactions d’extension amorce avec 4 ddNTPs sans étiquette peuvent être utilisées pour identifier des polymorphismes à un locus donné15,16,17 et a été largement adopté dans des applications cliniques pour la détection de la mutation et cancers diagnostiqués18. À l’aide de ces principes de base, nous avons créé un test exempte d’étiquette pour la détermination in vitro de l’ADN polymérase relecture activité exploitant la haute résolution, haute spécificité et haut débit potentiel de MALDI-TOF Mme utilisant la E. coli DNA polymérase I Klenow fragment comme enzyme modèle, dideoxyribonucleotide triphosphates (ddNTPs) comme substrats peuvent prendre un « instantané » de relecture des produits après un nucléotide simple extension par MALDI-TOF MS (Figure 1).
De même, cette méthode a été également développée pour un test de réparation de l’ADN où amorces contenant 3′ avant-dernier dI lésions font l’objet d’un PPS que j’ai réparer dosage qui imite endo V entaillé réparation intermédiaires. Bien que pas entièrement compris, la voie de réparation endo V est le seul système de réparation connu pour employer la pol I correction activité exonucléasique pour lésion excision19,20. À l’aide de MALDI-TOF MS, nous montrons un patch de réparation clairement défini où dI peut être excisé par pol I quand survenant dans les 2 dernières nt de l’apprêt avant d’ajouter le nucléotide correctement complété.
Pour l’étude de la relecture et la réparation de l’ADN, cette méthode est plus rapide et moins laborieux que les méthodes précédentes et fournit des informations supplémentaires vers le mécanisme et la fonction.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude décrit une étape par étape analyse d’activité de relecture analysée par l’instrument commercial choisi (voir la Table des matières) à l’aide de MALDI-TOF MS. Les principaux avantages comprennent que l’apprêt et le modèle sont étiquette gratuit et facile à exécuter, ce qui permet une plus grande flexibilité dans la conception des expériences. Un flux bâtards complète transformation de 30 essais de relecture prendrait 4 h, y compris 3 h pour effectuer manuellement les r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la NCFPB intégrée Core Facility de génomique fonctionnelle (Taipei, Taiwan) et le laboratoire de la pharmacogénomique NRPB (Taipei, Taïwan) pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation santé de Taiwan (L-I.L.) et le ministère des sciences et technologie, Taipei, Taiwan, ROC [plus 105-2320-B-002-047] pour Hu Wei-Yao, recherche [plus 105-2628-B-002-051-MY3] pour Su Kang-Yi et [ Most-105-2320-B-002-051-My3] pour Liang-en Lin.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. . DNA replication. , (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. 生物化学. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3′-5′ proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3′ penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
