교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여
Summary
교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.
Abstract
게놈의 충실 한 복제의 유지 보존 유전 정보에 대 한 최고 이다. 높은 충실도 복제, 평가 비 라는 간단한 개발 했습니다 하 고 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)와 함께 사용 하 여 라디오 동위-방법 질량 분석 (MS) 교정 연구에 대 한 분석. 여기, DNA 중 합 효소 [예를 들면, 대장균 DNA 중 합 효소의 Klenow 파편 (KF) 나 (폴 나)이 연구에서] 모든 4 개의 dideoxyribonucleotide 된 존재 일치 뇌관-템플릿 이중 처리 하는 데 사용 됩니다. 일치 하지 않는 입문서 다음 교정/확장 하 고 MALDI TOF MS를 받게. 제품은 단일 염기 변이 내려 뇌관의 질량 변화에 의해 구별 된다. 중요 한 것은, 한 교정 또한 확인할 수 있습니다 내부 단일 불일치에 대 한 다른 효율성에도 불구 하 고. 3′ 끝에서 2-4-뉴클레오티드 (nt)에 있는 불일치 효율적으로 했다, 폴에 의해 교정 그리고 5에서 불일치 뇌관 종점에서 nt만 부분 수정. 아니 교정 뇌관 3′ 끝에서 6-9 nt에 있는 내부 불일치에 대 한 발생 했습니다. 이 메서드는 또한 DNA 수리 분석 실험 (예를 들어, 엔 V 복구 경로 대 한 기판의 기본 병 변 수리 평가)에 적용할 수 있습니다. 뇌관 어 deoxyinosine (디) 병 변 3’를 포함 하는 폴에 의해 해결 될 수 나. 실제로, penultimate T-I, G-나, 그리고 A-나 기판 했다 그들의 마지막 2 디 포함 된 뉴클레오티드 excised 폴에 의해 나는 올바른 ddN 5′-monophosphate (ddNMP)를 추가 하기 전에 어 C 동안-나 불일치는 폴에 의해 용납 했다 나 뇌관 없이 확장 될 수 있도록 수리, 감도 및 해상도 MS의 DNA 복구를 측정 하는 분석 결과 보여주는.
Introduction
DNA 복제 시 DNA polymerases의 교정 기능 자손1,2,3,4,로 전송 하는 유전 정보의 높은 충실도 보장 하기 위해 필수적입니다. 5,,67. 중 합 효소 exonucleases 교정의 기여를 평가 하기 위해 수 있는 유전적 안정성을 보호 하는 메커니즘을 명확히 것.
방사성 표지와 젤 기반 분석 autoradiograms 또는 형광 이미징8,,910 의 densitometric 분석을 함께 전통적으로 DNA의 교정 활동을 탐지 하는 데 사용 되었습니다. polymerases입니다. 기능을 하는 동안 이러한 분석 실험, 비싼, 힘들고 높은 처리량 포맷 하지 의무가 있습니다. 또한, radioisotopes 폐기물 처리 등 안전 문제를 겪고 있습니다. 또는, 교정 활동 fluorometric 기술에 의해 분석 되어 있다. 예를 들어 2-aminopurine (2-AP) 생체 외에서 중 합 효소 분석 실험 생산 형광 신호11,12교정 동안 확장 제품에 통합할 수 있습니다. 2 AP thymine와 시 토 신 쌍 수 이후 불행 하 게도, 이러한 접근 낮은 특이성에서 고통. 더 최근의 접근 프로브를 포함 중요 한 G-quadruplex-기반 발광 스위치에는 중 합 효소에 대 한 중 합 효소의 일부를 극복 하는 분석 결과 교정에 대 한 단독으로 표시 된 형광 프로브로 서 3′-5′ exonuclease 분석 결과13 는 상기 단점14. 이러한 fluorometric 방법에 대 한 열정 DNA 기판의 특정 라벨에 대 한 필요 때문에 점감 된다.
반면, DNA 분석을 위한 TOF MALDI MS 뇌관 연장 반응 레이블이 없는 4 ddNTPs와 지정된 로커 스15,,1617 에 동 질 다 상 식별 하 사용 될 수 있는 정밀한 분석 결과에서 고용은 고 돌연변이 탐지에 대 한 임상 응용에 널리 채택 되었습니다 및 암 진단18. 이러한 기본 원칙을 사용 하 여, 우리는 높은 해상도, 높은 특이성 및 MALDI TOF 양 사용 중 의 높은 처리량 잠재력을 악용 하는 활동을 교정 하는 DNA 중 합 효소의 생체 외에서 결정에 대 한 레이블 없는 분석 결과 만든 대장균 DNA 중 합 효소 나 Klenow 모델 효소, dideoxyribonucleotide 된 (ddNTPs)으로 조각 기판 제품을 단일 뉴클레오티드 확장 통해 MALDI TOF MS (그림 1) 후 교정의 “스냅숏” 걸릴 수 있습니다.
마찬가지로,이 방법은 또한이 어디 포함 3′ 어 디 병 변 복구 나 폴을 복종 된다 뇌관 시험 어떤 모방도 긁어 V 수리 중간체 DNA 수리 분석 결과 대 한 개발 되었다. 완전히 이해 하는 동안 엔 V도 수리 통로 교정 exonuclease 활동 병 변의 절단19,20대 나는 폴을 알려진 유일한 복구 시스템입니다. 표시 사용 하 여 MALDI TOF MS, 우리는 명확 하 게 정의 된 수리 패치 어디 디 폴에 의해 excised 수 마지막 2에서 발생 하는 경우 나 올바른 보충된 뉴클레오티드를 추가 하기 전에 뇌관의 nt.
교정 및 DNA 복구의 연구를 위해이 방법은 빠르고 덜 이전 방법 보다는 힘이 드는 이며 메커니즘 및 기능으로 추가 정보를 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 선택한 상업 계기에 의해 분석 단계별 교정 활동 분석 결과 설명 ( 테이블의 자료를 참조) MALDI TOF MS를 사용 하 여. 주요 장점 포함 뇌관 및 템플릿 레이블 무료로 쉽게 수행 하는 실험 설계에서 더 큰 유연성을 허용 합니다. 스트림-석 회 완전 한 테스트를 교정 하는 30의 처리 등 수동으로 교정 반응을 수행 하기 위한 3 h 4 h 고 MALDI TOF MS 분석 위에서 언급 한 프로토콜을 사용 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 NCFPB 통합 핵심 시설 기능 유전체학 (타이페이, 대만)와 그들의 기술 지원에 대 한 NRPB Pharmacogenomics 연구소 (타이페이, 대만). 이 작품에서 대만 건강 재단 (L-I.L.) 사역의 과학 및 기술, 타이 페이, 대만, ROC [가장 105-2320-B-002-047] 웨이 야 오 주석, 연구 보조금에 의해 지원 되었다 [가장 105-2628-B-002-051-MY3] 강이 수, 및 [ MOST-105-2320-B-002-051-MY3] 회담에 린에 대 한.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
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