Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse
Summary
Eine nicht beschriftet, nicht-Radio-Isotopen Methode zur DNA-Polymerase Korrekturlesen und eine DNA-Reparatur-Assay wurde mithilfe von hochauflösenden MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine Einzel-Nukleotid-Erweiterung-Strategie entwickelt. Der Test erwies sich als zu sehr spezifischen, einfache, schnelle und einfach durchzuführen, für das Korrekturlesen und reparieren kürzer als 9-Nukleotide patches.
Abstract
Die Wartung des Genoms und seine treuen Replikation ist von größter Bedeutung für die Erhaltung der genetischen Information. Um High-Fidelity-Replikation zu bewerten, haben wir eine einfache, nicht beschriftet und nicht-Radio-Isotopen-Methode mit einer Matrix-assisted Laser Desorption ionisation mit Time-of-Flight (MALDI-TOF) Masse Massenspektrometrie (MS)-Analyse für ein Lektorat Studie. Hier, eine DNA-Polymerase [z. B. das Klenow-Fragment (KF) von Escherichia coli DNA-Polymerase ich (Pol ich) in dieser Studie] in Anwesenheit aller vier Dideoxyribonucleotide Triphosphate wird verwendet, um eine nicht übereinstimmende Grundierung-Vorlage Maisonette verarbeiten. Die nicht übereinstimmende Grundierung ist dann erweitert/Korrekturlesen und MALDI-TOF MS unterzogen. Die Produkte zeichnen sich durch die Massenänderung der Grundierung auf Einzel-Nukleotid-Variationen. Wichtig ist, kann eine Korrektur auch für interne einzelnen Fehlanpassungen, wenn auch mit unterschiedlicher Effizienz ermittelt werden. Fehlanpassungen gelegen in 2-4-Nukleotide (nt) von 3′-Ende waren effizient Korrekturlesen von Pol ich, und ein Missverhältnis bei 5 nt von der Grundierung Endstation zeigte nur eine partielle Korrektur. Keine Korrektur erfolgte für interne Konflikte am 6-9 nt vom Primer 3′ Ende. Diese Methode kann auch zur DNA-Reparatur-Assays (z. B. Beurteilung eine Basis-Läsion Reparatur von Substraten für den Endo V Reparatur Weg) angewendet werden. Primer mit 3′ vorletzten Deoxyinosine (dI) Läsionen durch Pol korrigiert werden könnte ich. In der Tat vorletzten T-I, G-I und A-ich Substrate hatte ihre letzte 2 dI-haltigen Nukleotide herausgeschnitten von Pol ich vor dem Hinzufügen eines richtigen DdN 5′-Monophosphate (DdNMP) beim vorletzten C-ich Diskrepanzen wurden toleriert, von Pol I, so dass die Grundierung ohne erweitert werden Reparatur, zeigen, dass die Empfindlichkeit und Auflösung der MS Test zur Messung der DNA-Reparatur.
Introduction
Die Korrekturlesen Funktionen von DNA-Polymerasen während der DNA-Replikation sind Voraussetzung für High-Fidelity der genetischen Information, die auf Nachkommen1,2,3,4übertragen werden muss, 5,6,7. Um die Beiträge der Polymerase Korrekturlesen exonucleasen beurteilen würde die Mechanismen, die Sicherung der genetischen Stabilität klären.
Kennzeichnung von Radioisotopen und Gel-basierte Assays in Kombination mit densitometrische Analysen von Autoradiograms oder Phosphor bildgebenden8,9,10 haben traditionell verwendet, um Korrekturlesen Tätigkeit der DNA zu erkennen Polymerasen. Während funktionell, sind diese Tests aufwändig, teuer und Hochdurchsatz-Formate nicht zugänglich. Darüber hinaus leiden Radioisotope Sicherheitsfragen einschließlich Entsorgung. Alternativ haben Korrekturlesen Aktivitäten fluorometrisch Techniken analysiert wurde. Zum Beispiel kann 2-Aminopurine (2-AP) Erweiterungsprodukte bei in-vitro- Polymerase Korrekturlesen Assays um ein Fluoreszenzsignal11,12produzieren integriert werden. Leider leiden diese Ansätze eine geringe Spezifität, da 2-AP mit Thymin und Cytosin koppeln kann. Neuere Ansätze beinhalten einer sensible G-Quadruplex-basierte lumineszierenden einschalten Sonde für eine Polymerase 3′ – 5′ Exonuclease Assay13 sowie einzeln beschriftet fluoreszierende Sonde für eine Polymerase Korrekturlesen Assay, die einige der überwindet die genannten Nachteile14. Begeisterung für diese fluorometrischen Methoden wird aufgrund der Notwendigkeit, die spezifische Kennzeichnung von DNA-Substrate vermindert.
Im Gegensatz dazu beschäftigt ein MALDI-TOF MS für DNA-Analysen in PinPoint-Assay, wo die Grundierung Erweiterung Reaktionen mit unbeschrifteten 4 Ddntp können zur Polymorphismen bei einem bestimmten Locus15,16,17 zu identifizieren und verbreitet in der klinischen Anwendung bei Mutation Erkennungen und Krebs diagnostiziert18. Mit diesen Grundprinzipien, schufen wir einen markierungsfreie Assay zur in-vitro- Bestimmung der DNA-Polymerase Korrekturlesen Tätigkeit nutzen die hohe Auflösung, hohe Spezifität und Hochdurchsatz-Potenzial der MALDI-TOF MS. mit E. coli DNA-Polymerase ich Klenow als ein Modell-Enzym, Dideoxyribonucleotide Triphosphate (DdNTPs Fragment) wie Substrate können eine “Momentaufnahme” Korrekturlesen Produkte nach ein Einzel-Nukleotid-Erweiterung über MALDI-TOF MS (Abbildung 1).
Ebenso wurde diese Methode auch entwickelt für einen DNA-Reparatur-Assay wo assay Primer mit 3′ vorletzten dI Läsionen ein Pol ausgesetzt sind, die ich reparieren, welche Mimik Endo V geklaut Reparatur Zwischenprodukte. Zwar nicht vollständig verstanden, ist der Endo V Reparatur Weg das einzige Reparatursystem bekannt, dass der Pol ich Korrekturlesen Exonuclease Tätigkeit für Läsion Exzision19,20beschäftigen. Mit MALDI-TOF MS, wir zeigen einen klar definierten Reparatur-Patch wo dI von Pol herausgeschnitten werden, kann ich in den letzten 2 auftritt nt die Grundierung vor der Zugabe der richtigen ergänzt Nukleotid.
Für die Studie der Korrekturlesen und DNA-Reparatur diese Methode ist schneller und weniger aufwändig als bisherige Methoden und bietet zusätzliche Informationen zum Mechanismus und Funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie beschrieben einen Schritt für Schritt Korrekturlesen Tätigkeit Assay von der gewählten kommerziellen Instrument analysiert (siehe die Tabelle der Materialien) mit MALDI-TOF MS. Die großen Vorteile sind, dass die Grundierung und Vorlage Etikett kostenlos und einfach zu führen, ermöglicht größere Flexibilität bei der Versuchsplanung. Ein Stream-Kalk vollständige Verarbeitung von 30 Korrekturlesen Tests 4 h, 3 h beim manuellen Abgleich der Korrekturlesen Reaktionen einschließlich neh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den NCFPB integrierte Core Facility für Functional Genomics (Taipei, Taiwan) und NRPB Pharmacogenomics Labor (Taipei, Taiwan) für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt von Forschungsstipendien aus Taiwan Health Foundation (L-i.l.) und das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taipei, Taiwan, ROC [die meisten 105-2320-B-002-047] für Hu Wei-Yao, [die meisten 105-2628-B-002-051-MY3] für Kang-Yi Su und] Most-105-2320-B-002-051-MY3] für Liang In Lin.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
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