الإنتاج والتصور جدارها البكتيرية وبروتوبلاستس لتميز التعريب الببتيد مضادات الميكروبات
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لإنتاج الغرام الإشريكيّة القولونية (كولاي) جدارها وإيجابية Bacillus megaterium (باء-ميجاتيريوم) بروتوبلاستس تصور واضح وتميز سرعة التفاعلات البكتيريا الببتيد. يوفر هذا أسلوب منهجي لتعريف غشاء إضفاء الطابع المحلي وترانسلوكاتينج الببتيدات.
Abstract
تحول دون استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] كطريقة لتقييم أنماط التعريب الببتيد داخل البكتيريا عادة بحدود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية. كما لا يمكن تعزيز القرار مجهر معين بسهولة، نقدم البروتوكولات لتحويل صغيرة على شكل قضيب الغرام الإشريكيّة القولونية (كولاي) وإيجابية Bacillus megaterium (ميجاتيريوم) ودعا إلى أشكال كروية المصورة بسهولة أكبر، وجدارها أو بروتوبلاستس. ويسمح هذا التحول المراقبين لتحديد سرعة ووضوح سواء الببتيدات تقديم أنفسهم إلى الغشاء الجرثومي (أي، ترجمة غشاء) أو عبر الغشاء بدخول الخلية (أي، ترانسلوكاتينج). مع هذا النهج، نقدم أيضا أسلوب منهجي لتوصيف الببتيدات كغشاء إضفاء الطابع المحلي أو ترانسلوكاتينج. بينما يمكن استخدام هذا الأسلوب لمجموعة متنوعة من الببتيدات غشاء نشطة والسلالات البكتيرية، نظهر فائدة هذا البروتوكول عن طريق مراقبة التفاعل بين بوفورين الثاني P11A (BF2 P11A)، ببتيد مضادات الميكروبات (أمبير)، مع كولاي جدارها وبروتوبلاستس ميجاتيريوم (ب) .
Introduction
وقد اكتسبت الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير) الاهتمام بسبب إمكانية استخدامها كبدائل للمضادات الحيوية التقليدية1،2،3،،من45. الامبير تقتل البكتيريا أما ترانسلوكاتينج عبر غشاء الخلية، والتفاعل مع المكونات داخل الخلايا مثل الأحماض النووية أو بيرميبيليزينج الغشاء مما تسبب في تسرب محتويات الخلية6. بالإضافة إلى استخدامها كالمضادات الحيوية، ترانسلوكاتينج الامبير قد تكون مكيفة لطلبات تسليم المخدرات نظراً لأنها غير ديسروبتيفيلي يمكن عبر7،غشاء الخلية كتيمة8. ولذلك، نحن، تسعى إلى فهم آليات أمبير الأساسية العمل على إرساء الأسس لاستخدامها في تصميم الأدوية.
[كنفوكل] الفحص المجهري يوفر وسيلة لتقييم أنماط الترجمة من الامبير المسمى فلوريسسينتلي في الخلايا البكتيرية تقديم رؤى في إليه العمل9،10،،من1112، 13 , 14-بوصفها غشاء البكتيريا، واحد يمكن تحديد إذا يموضع ببتيد مسمى فلوريسسينتلي للغشاء أو الفضاء داخل الخلية للخلية البكتيرية. ومع ذلك، يقتصر هذا الأسلوب الشكل صغيرة الحجم وقضيب من البكتيريا، والتي يمكن أن تجعل التصوير صعبة بسبب حدود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية والاتجاه المتغير من البكتيريا على شريحة15.
وهدف طريقة عرض تمكين التصور تعزيز أنماط التعريب الببتيد المسمى فلوريسسينتلي باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. هو تعزيز التصور بتحويل صغيرة، رقيقة، على شكل قضيب الغرام الإشريكيّة القولونية (كولاي) وإيجابية Bacillus megaterium (ميجاتيريوم) البكتيريا إلى أشكال كروية الموسع، ويشار إليه بوصفه جدارها (لسلالات الغرام) وبروتوبلاستس (لسلالات إيجابية)16،17،،من1819،،من2021. جدارها وبروتوبلاستس أسهل للصورة بسبب زيادة حجمها وشكلها متماثل، مما يجعل التوجه للبكتيريا على شريحة غير ذي صلة التصوير. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم مقاربة منهجية لتحليل البيانات مجهرية [كنفوكل] كمياً لوصف الامبير الغشاء أما محلياً أو ترانسلوكاتينج. تطبيق هذه الأساليب يجعل من السهل التمييز بين المسمى فلوريسسينتلي أنماط التعريب الببتيد. يمكن استخدام البروتوكولات المقدمة هنا لتقييم إضفاء الطابع المحلي على مجموعة متنوعة من العوامل النشطة غشاء خلاف المكاتب الإقليمية للمرأة، بما في ذلك اختراق الخلية الببتيدات.
واحد ميزة واضحة لهذا الأسلوب هو أن فإنه يوفر نظرة ثاقبة إليه العمل للمكاتب الإقليمية للمرأة على مستوى خلية واحدة، التي قد تكشف التغايرية خلية إلى15، بدلاً من فحوصات الفلورية الأخرى استخداماً لتحديد آليات العمل للمكاتب الإقليمية للمرأة، التي توفر معظم التقديرات9،،من2223،24،25فقط. استخدام جدارها وبروتوبلاستس من أجل تقييم إدخال خلية أمبير هي مفيدة خاصة26 لأنها ذات الصلة أكثر فسيولوجيا15 من النماذج الأخرى المستخدمة لتقييم إدخال خلية، مثل الدهن حويصلات24.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكولات المقدمة هنا جعله قابلاً للباحثين للحصول على أحجام العينة أكبر من الصور البكتيرية أكثر سرعة لأن البكتريا الموسع، كروية أسهل بكثير تحديد وتوجيه، وصورة. هذه القدرة المحسنة لجمع البيانات قيمة من نواح عدة. أولاً، أنه يمكن تحليل كمي أكثر منهجية لأنماط التعريب الببتيد. بينما يمكن ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان دعم البحوث “المعهد الوطني للحساسية” و “الأمراض المعدية” (المعاهد الوطنية للصحة-نييد) جائزة R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. . Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. 生物化学. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
