Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione
Summary
Qui presentiamo un protocollo per produrre gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) Sferoplasti e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplasti di visualizzare chiaramente e rapidamente caratterizzare interazioni del peptide-batteri. Questo fornisce un metodo sistematico per definire membrana localizzazione e dispostamento peptidi.
Abstract
L’uso della microscopia confocale come un metodo per valutare i modelli di localizzazione del peptide all’interno batteri comunemente è inibita dai limiti della risoluzione dei microscopi ottici convenzionali. Come la risoluzione di un microscopio dato non può essere facilmente migliorata, vi presentiamo protocolli per trasformare la piccola a forma di bastoncello gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) in forme sferiche più grandi, facilmente imaged chiamarono Sferoplasti o protoplasti. Questa trasformazione permette agli osservatori di rapidamente e chiaramente determinare se peptidi presentare se stessi nella membrana batterica (cioè, localizzazione di membrana) o attraversano la membrana per entrare nella cellula (cioè, dispostamento). Con questo approccio, inoltre presentiamo un metodo sistematico per caratterizzare i peptidi come membrana localizzazione o dispostamento. Mentre questo metodo può essere utilizzato per una varietà di peptidi attivi di membrana e ceppi batterici, dimostriamo l’utilità del presente protocollo osservando l’interazione di Buforin II P11A (BF2 P11A), un peptide antimicrobico (AMP), con e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti.
Introduction
Peptidi antimicrobici (amp) hanno guadagnato l’attenzione a causa del loro potenziale utilizzo in alternativa agli antibiotici convenzionali1,2,3,4,5. Amplificatori per uccidono i batteri sia dispostamento attraverso la membrana cellulare e interagendo con componenti intracellulari quali gli acidi nucleici o di permeabilizing la membrana provocando perdite di cella contenuto6. Oltre al loro uso come antibiotici, dispostamento amplificatori può essere adattato per le applicazioni di consegna di droga perché essi senza interruzioni possono attraversare la membrana cellulare impermeabile7,8. Di conseguenza, cerchiamo di capire i meccanismi di azione di gettare le basi per il loro uso nel disegno della droga fondamentali-AMP.
Microscopia confocale offre un modo per valutare i modelli di localizzazione degli amplificatori fluorescente identificati nelle cellule batteriche fornendo intuizioni loro meccanismo di azione9,10,11,12, 13 , 14. identificando la membrana dei batteri, si può determinare se un peptide fluorescente contrassegnato si localizza la membrana o spazio intracellulare di una cellula batterica. Tuttavia, questa tecnica è limitata dalla piccola dimensione e rod forma di batteri, che possono rendere impegnativa a causa di limiti di risoluzione dei microscopi ottici convenzionali e l’orientamento variabile dei batteri sulla diapositiva15di imaging.
L’obiettivo del metodo presentato è quello di attivare la visualizzazione avanzata dei modelli di localizzazione del peptide fluorescente identificati usando la microscopia confocal. Visualizzazione è migliorato girando la piccola, sottile, a forma di bastoncello gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) batteri in forme sferiche, allargate indicato come Sferoplasti (per ceppi gram-negativi) e protoplasti (per ceppi gram-positivi)16,17,18,19,20,21. Sferoplasti e protoplasti sono più facili da immagine a causa della loro maggiore dimensione sia loro forma simmetrica, che rende l’orientamento di un batterio su un vetrino irrilevante per la sua rappresentazione. Inoltre, vi presentiamo un approccio sistematico per analizzare quantitativamente dati di microscopia confocale per caratterizzare AMPs come entrambi membrana localizzazione o dispostamento. L’applicazione di questi metodi rende più facile distinguere fluorescente etichettati modelli di localizzazione del peptide. I protocolli presentati qui possono essere utilizzati per valutare la localizzazione di una varietà di agenti di membrana-attivo diverso da AMPs, compresi peptidi cellula-penetrante.
Un vantaggio di questa tecnica è che esso fornisce il meccanismo di azione degli amplificatori: approfondimenti a livello di singola cellula, che può rivelare la cellula–cellula eterogeneità15, al contrario di altre analisi di fluorescenza comunemente utilizzato per identificare il meccanismi di azione degli amplificatori, che forniscono soltanto alla rinfusa stime9,22,23,24,25. L’uso di Sferoplasti e protoplasti al fine di valutare la voce di cella AMP è utile particolare26 perché sono più fisiologicamente rilevanti15 rispetto ad altri modelli utilizzati per la valutazione della voce di cella, ad esempio di vescicole lipidiche24.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli qui presentati rendono fattibile per i ricercatori per ottenere più rapidamente più grandi dimensioni del campione di immagini batteriche perché i batteri allargati, sferici sono molto più facili da individuare, orientare e dell’immagine. Questa maggiore capacità di raccogliere dati è utile sotto diversi aspetti. In primo luogo, consente un’analisi quantitativa più sistematica dei modelli di localizzazione del peptide. Mentre le tendenze qualitative possono essere dimostrate da più piccoli insiemi di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive (NIAID-NIH) award R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
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