Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) produzieren Spheroplasts und gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) Protoplasten deutlich sichtbar zu machen und schnell charakterisieren Peptid-Bakterien Interaktionen. Dies bietet eine systematische Methode zur Membran Lokalisierung und translocating Peptide zu definieren.
Abstract
Die Verwendung der konfokalen Mikroskopie als eine Methode zur Bewertung von Peptid-Lokalisierung-Muster in Bakterien ist häufig durch die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen gehemmt. Da die Auflösung für einen bestimmten Mikroskop nicht leicht verbessert werden kann, präsentieren wir Protokolle, um die kleinen stabförmigen Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) und die gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) verwandeln in größeren, leicht abgebildeten Sphärische Formen Spheroplasts oder Protoplasten genannt. Diese Transformation ermöglicht Beobachter schnell und eindeutig zu bestimmen, ob Peptide sich in die bakterielle Membran (z.B. Membran Lokalisierung nisten) oder überqueren Sie die Membran die Zelle (z.B. translocating) eingeben. Mit diesem Ansatz stellen wir auch eine systematische Methode zur Charakterisierung von Peptiden als Membran Lokalisierung oder translocating. Während diese Methode für eine Vielzahl von Membran-aktive Peptide und Bakterienstämme verwendet werden kann, zeigen wir die Nützlichkeit dieses Protokolls durch Beobachtung der Interaktion von Buforin II P11A (BF2 P11A), eine antimikrobielle Peptide (AMP), mit E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten.
Introduction
Antimikrobielle Peptide (AMPs) haben Aufmerksamkeit durch ihre mögliche Verwendung als Alternative zu herkömmlichen Antibiotika1,2,3,4,5gewonnen. Ampere töten Bakterien, indem Sie entweder über die Zellmembran translocating und Interaktion mit intrazellulären Komponenten wie Nukleinsäuren oder durch die Membran verursacht Leckage der Zelle Inhalt6permeabilizing. Neben dem Einsatz als Antibiotika kann translocating AMPs für Drug Delivery Anwendungen angepasst werden, weil sie unterbrechungsfrei die wasserundurchlässigen Zellmembran7,8überqueren können. Wir versuchen daher, grundlegende AMP Wirkmechanismen, legen Sie den Grundstein für ihre Nutzung in Wirkstoffdesign zu verstehen.
Konfokalen Mikroskopie bietet eine Möglichkeit, Lokalisierung Muster von eindringmittel beschriftet Ampere in Bakterienzellen, die Einblicke in den Mechanismus der Aktion9,10,11,12, bewerten 13 , 14. durch Kennzeichnung der Membran der Bakterien, kann man feststellen, ob eine eindringmittel beschriftete Peptid, die Membran oder den intrazellulären Raum einer bakteriellen Zelle lokalisiert. Allerdings ist diese Technik durch die kleine Größe und Rod Form von Bakterien, begrenzt die imaging anspruchsvoll durch die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen und die Variable Ausrichtung der Bakterien auf der Folie15machen kann.
Die vorgestellte Methode soll verbesserte Visualisierung der Gewebekulturen beschrifteten Peptid Lokalisierung Muster mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie ermöglichen. Visualisierung wird ergänzt durch Drehen der kleinen, dünnen, stabförmige Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) und gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) Bakterien in erweiterten, sphärische Formen genannt Spheroplasts (bei Gram-negativen Stämme) und Protoplasten (für Gram-positive Stämme)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts und Protoplasten sind aufgrund ihrer Größe und ihrer symmetrischen Form, wodurch die Ausrichtung eines Bakteriums auf einer Folie irrelevant für die Bildgebung einfacher zu Bild. Darüber hinaus präsentieren wir einen systematischen Ansatz, um quantitativ konfokalen Mikroskopie Daten auswerten, um AMPs als entweder Membran Lokalisierung oder translocating zu charakterisieren. Anwendung dieser Methoden macht es leichter zu unterscheiden eindringmittel Peptid Lokalisierung Muster beschriftet. Die hier vorgestellten Protokolle können verwendet werden, um die Lokalisierung von einer Vielzahl von Membran-aktive Akteure als Verstärker, einschließlich der Zelle eindringen Peptide zu beurteilen.
Ein Vorteil dieser Technik ist, dass es Einblicke in den Mechanismus der Wirkung von AMPs auf eine einzelne Zelle-Ebene bietet die Heterogenität von Zelle zu Zelle15, im Gegensatz zu anderen Fluoreszenz-Assays häufig verwendet, um ermitteln zu offenbaren, kann die Mechanismen der Wirkung von AMPs, die nur lose Schätzungen9,22,23,24,25zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung von Spheroplasts und Protoplasten AMP Zelleintrag Beurteilung ist insbesondere nützlich26 , weil sie mehr physiologisch relevanten15 als andere Modelle zur Bewertung von Zelleintrag wie Lipid Vesicles24sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellten Protokolle machen es möglich für Forscher, schneller größere Stichprobengrößen der bakteriellen Bilder zu erhalten, weil die erweiterten, kugelförmigen Bakterien viel einfacher sind zu finden, orientieren und Bild. Diese verbesserte Fähigkeit, Daten zu sammeln lohnt sich in mehrfacher Hinsicht. Erstens ermöglicht es eine systematischere Quantitative Analyse der Peptid-Lokalisierung-Muster. Während qualitative Entwicklung von kleineren Mengen von Bildern nachgewiesen werden können, nur ei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung wurde vom National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (NIH-NIAID) Award R15AI079685 unterstützt.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
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