פלטפורמה Microphysiologic שומן אנושי: דחוקה שומן לבן
Summary
שומן לבן (וואט) יש ליקויים קריטי הדגמים תרבות הראשי הנוכחי שלה, הפרעה מטבולית מחקרים ופיתוח תרופתי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מערכת microphysiological אדיפוז מאת וואט sandwiching בין גליונות של תאי סטרומה. מבנה זה מספק פלטפורמה יציבה וניתנת להתאמה לתרבות וואט העיקרי.
Abstract
שומן לבן (וואט) ממלא תפקיד חשוב בוויסות משקל ובריאות כל יום. עדיין, ישנם מגבלות משמעותיות דגמי התרבות העיקריים הזמינים, אשר כולם נכשלו בנאמנות לסכם את microenvironment אדיפוז או להרחיב את הכדאיות וואט מעבר שבועיים. העדר מודל אמין תרבות ראשי פוגעת קשות במחקר וואט חילוף החומרים, פיתוח תרופות. למטרה זו אנו מסויימת סטנדרטים של NIH של מערכת microphysiologic לפתח פלטפורמה חדשנית לתרבות העיקרי וואט בשם ‘ימ מ’ (דחוקה שומן לבן). לנו להתגבר על ציפה טבעית של adipocytes על ידי sandwiching טחון אשכולות וואט בין גליונות של שומן-derived תאי סטרומה. את המבנה הזה, הם דוגמאות וואט קיימא מעל שמונה שבועות בתרבות. הימ מ מקיים את ECM ללא פגע, מתא לתא אנשי לחצים פיזיים של ויוו תנאים וואט; בנוסף, הימ מ מתחזקת פרופיל תעתיק עמיד, רגישות איתות כימי אקסוגני, תפקוד הרקמות שלם. הימ מ מייצג שיטה פשוטה, לשחזור ויעיל של תרבות אדיפוז העיקרי. פוטנציאל זה פלטפורמה ישים בקנה מידה נרחב לחקר וואט פיזיולוגיה, פתופיזיולוגיה, חילוף החומרים ופיתוח תרופות.
Introduction
רקמת שומן הוא האיבר הראשי של השמנת יתר, אשר נושאת הוצאות רפואיות שנתיות ישיר בין 147 מיליארד דולר ל- 210 מיליארד דולר ארה ב1. ההצטברות של רקמת שומן תורם גם גורמים נוספים המובילים למוות כגון מחלות לב, מסוכרת מסוג II, סוגים מסוימים של סרטן2. In vitro לקשרי תרבות מודלים הם חיוניים עבור מחקרים מטבולית, פיתוח תרופות, אבל המחקר הנוכחי, דגמי רקמת שומן יש ליקויים עיקריים. Adipocytes עדין, קליל, סופני הבדיל תאים לא דוגלים תא תרבות פלסטיק, ותרבותית ולכן לא יכול להיות בשיטות תרבות תא קונבנציונלי. מאז שנות השבעים, מספר שיטות השתמשו בתיבה נסיונות כדי להתגבר על מחסומים אלה, לרבות השימוש coverslips זכוכית דקה, התקרה תרבות, תרבות השעיה ו מטריצה חוץ-תאית3,4,5, 6 , 7. עם זאת, שיטות אלה סומנו על ידי מוות של תאים dedifferentiation, הם משמשים בדרך כלל לא יותר מאשר תקופת לימודים שבועיים. יתר על כן, מודלים אלה אל תנסה לסכם את microenvironment אדיפוז מקורי כפי שהם לא לשמור על ECM ללא פגע את, לתמוך האינטראקציות בין adipocytes לבין סטרומה תאים, ולא התאים כוחות כויץ להפעיל אחד על השני ב ויוו וואט.
בהיעדר שיטת תרבות אדיפוז העיקרי תקן הזהב, מחקר אדיפוז הסתמכה בעיקר על הבדיל טרום adipocytes (diffAds). DiffAds הם multilocular, חסיד, ועל פעילות סמויה. לעומת זאת, ראשי adipocytes לבן הן unilocular, nonadherent, להדגים מטבוליזם נמוך יחסית. הכישלון של המודלים הנוכחיים של אדיפוז התרבות רוצה להתרכז הפיזיולוגיה של רקמת שומן בוגרת בריאה הוא כנראה גורם מרכזי בהיעדרו של תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA שכוונו ישירות adipocytes. למעשה, חוסר הפיזיולוגיות במבחנה איברים מודלים היא בעיה רצינית על פני רוב האיברים ומחלות.
בנייר העמדה שלו מכריזים על הקמתה של תכנית Microphysiological מערכות (MPS) שלה, במכון הלאומי של בריאות (NIH) דיווחו כי שיעור ההצלחה 2013 על פני כל ניסויים קליניים בבני התרופות רק 18% עבור שלב II ו 50% עבור שלב III ניסויים קליניים8. התוכנית MPS מיועד לפנות ישירות היא חוסר מונוקולטורה במבחנה על הפיזיולוגיה האנושית מודל. NIH מגדירה MPSs מערכות התרבות המורכב ראשית אנושי או בתאי גזע multicellular מבנים תלת-ממד זה מסכם את הדברים תפקוד איברים. בניגוד רדיוקציוניסטי מודלים של תרבויות הומוגניות, מונצחים תא, MPSs צריך באופן מדויק תאים תאים, סמים-תא, -תרופתיים ו עוגב תרופתיים אינטראקציות9. שלא כמו שיטות התרבות העיקרי לטווח קצר, תקנים NIH להכתיב MPS קיימות מעל 4 שבועות ב תרבות8. ניתן למצוא פרטים נוספים על התוכנית MPS של NIH RFAs (#RFA-TR-18-001)10.
פיתחנו פשוטה, רומן, יכולת הסתגלות, חברי הפרלמנט אדיפוז זול כינה “דחוקה שומן לבן” (ימ מ)11. לנו להתגבר על ציפה טבעית של adipocytes על ידי “sandwiching” טחון העיקרי רקמת שומן בין גליונות של שומן-derived סטרומה תאים (ADSCs) (איור 1). הבונה 3D שנוצר recapitulates הקשר תא-תא, microenvironment של אדיפוז מקורי על-ידי תחימת adipocytes בוגרת עם אוכלוסיה תא תמיכה adipocyte טבעי. הימ מ אומתה על ידי הפגנת 8 שבועות הכדאיות, תגובה ל אקסוגניים איתות, הפרשת adipokine ו- engraftment לתוך במודל חיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מפרט את השימוש ADSCs כדי סנדוויץ האנושי שומן לבן; שורות תאים ADSC האנושי ניתן לבודד באמצעות פרוטוקולים ומבוססת15. עם זאת, המערכת ניתן להתאים לדרישות המחקר תגובותיהם (כגון שימוש 3T3L-1 תאים כריך העכבר וואט). תהליך זה כרוך הטיפול העיקרי רקמה אנושית. צריך להיות מועסק סטנדרט זה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר את התמיכה המוסדי שמספק LSU למדעי הבריאות מרכז, אשר מימנה את הפרויקט.
Materials
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75°C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
- Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
- Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
- Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
- Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
- . NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017)
- Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
- Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 – is it thermogenesis?. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).
