Summary

İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

Published: August 15, 2018
doi:

Summary

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) farmakolojik geliştirme ve metabolik çalışmalar engelleyen onun geçerli birincil kültür modelleri içinde önemli eksiklikleri vardır. Burada, bir yağ microphysiological sistem tarafından sandviç WAT levha stromal hücreler arasında üretmek için bir protokol mevcut. Bu yapıyı birincil WAT kültür için istikrarlı ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

Abstract

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) ağırlık ve her gün sağlık düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Yine de, mevcut birincil kültür modelleri, tüm bunların sadakatle adipose microenvironment özetlemek veya WAT canlılık iki hafta ötesinde genişletmek için başarısız olmuş önemli sınırlamalar vardır. Güvenilir birincil kültür manken eksikliği ciddi araştırma WAT metabolizma ve ilaç geliştirme engellemektedir. Bu amaçla NIH’ın standartları için WAT birincil kültür ‘SWAT’ (gözükeceksin beyaz yağ dokusu) adı verilen yeni bir platform geliştirmek için bir microphysiologic sisteminin kullanılan. Adiposit doğal yüzdürme kıyılmış WAT kümeleri stromal hücreler yağ kaynaklı levha arasında sandviç tarafından üstesinden gelmek. Bu yapıyı kültür uygun üzerinde sekiz hafta WAT örnekleri var. SWAT sağlam ECM, hücre hücre kişiler ve in vivo WAT koşullardan fiziksel baskılara tutar; Ayrıca, SWAT sağlam bir transkripsiyon profil eksojen kimyasal sinyal ve bütün doku fonksiyon duyarlılık korur. SWAT birincil adipose kültür basit, tekrarlanabilir ve etkili bir yöntem temsil eder. Büyük olasılıkla, WAT fizyolojisi, patofizyolojisi, metabolizma ve ilaç geliştirme araştırmaları genel olarak uygun bir platformdur.

Introduction

Yağ dokusu içinde ABD1147 milyar dolar ve 210 milyar dolar arasında doğrudan yıllık tıbbi maliyeti taşır obezite birincil organıdır. Yağ doku birikimi de önde gelen diğer kalp hastalığı, tip II diyabet ve kanser2belirli türleri gibi ölüm nedenleri katkıda bulunur. Vitro kültür modelleri metabolik çalışmaları ve ilaç geliştirme için gerekli olan, ama yağ dokusu geçerli araştırma modelleri büyük eksiklikleri var. Adiposit kırılgan, neşeli ve ölümcül hücre kültür plastikler için uygun olmaz ve bu nedenle geleneksel hücre kültür yöntemleri kullanarak kültürlü cant hücreleri Ayrıştırılan. Cam coverslips, tavan kültür, süspansiyon kültür ve ekstraselüler matrisler3,4,5, kullanımı da dahil olmak üzere bu engelleri aşmak için girişimleri birkaç yöntem kullanılmıştır 1970’lerden beri 6 , 7. ancak, bu yöntemlerin hücre ölümü ve dedifferentiation tarafından işaretlenmiş ve genellikle en fazla bir iki haftalık çalışma dönemi için kullanılır. Ayrıca, bu modeller yapmak değil kalkışmak gibi sağlam ECM korumak değil, etkileşimleri adiposit arasında ve stromal hücreler destek, ne de contractile kuvvetleri hücrelerin birbirlerine içinde içinde vivo sarfetmek yerli adipose microenvironment özetlemek WAT.

Altın standart birincil adipose kültür yöntemi yokluğunda, öncelikle farklılaştırılmış öncesi adiposit üzerinde (diffAds) yağ araştırma güvendi. DiffAds multilocular, yapışık ve metabolik olarak aktif. Buna karşılık, birincil beyaz adiposit üniloküler, nonadherent ve nispeten düşük metabolizma göstermek. Sağlıklı Olgun yağ dokusu fizyolojisi özetlemek için geçerli adipose kültür modellerin büyük olasılıkla doğrudan hedef adiposit FDA onaylı ilaçlar yokluğunda önemli bir faktör başarısızlıktır. Aslında, fizyolojik vitro organ modelleri büyük bir sorun birçok organ ve hastalık olmaması.

Onun pozisyon kağıt, Microphysiological sistemleri (MPS) programın yaratılması duyurmak Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tüm insan ilaç klinik çalışmalar arasında 2013 başarı oranı sadece %18 için faz II ve Evre III için % 50 olduğunu bildirdi Klinik çalışmalarda8. MPS programı doğrudan vitro Monokültür yetersizlik modeli insan fizyolojisi için karşılayacak şekilde tasarlanmıştır. NIH MPSs insan birincil veya kök hücreler organ işleyen özetlemek çok hücreli 3D yapıları içinde oluşan kültür sistemleri olarak tanımlar. Homojen, ölümsüzleştirdi hücre kültürleri indirgemeci modellerinin MPSs doğru bir şekilde hücre-hücre, hücre içi uyuşturucu, ilaç-ilaç ve organ-ilaç etkileşimleri9modeli. Kısa vadeli birincil kültür yöntemlerinden farklı olarak, NIH standartları 4 haftadan kültür8MPS sürdürülebilirlik dikte. NIH’ın RFAs (#RFA-TR-18-001)10, MPS programının daha fazla bilgi bulunabilir.

Basit, bir roman, uyarlanabilir, geliştirdiğimiz ve ucuz yağ MPS olarak adlandırdığı “beyaz yağ dokusu sandviç” (SWAT)11. “Sandviç” kıyılmış birincil yağ dokusu stromal hücreler (ADSCs) (resim 1) yağ kaynaklı levha arasında tarafından adiposit doğal yüzdürme üstesinden gelmek. Elde edilen 3D yapı hücre-hücre iletişim ve doğal yağ microenvironment bir doğal adipocyte destek hücre popülasyonu içeren olgun adiposit çevreleyen tarafından beyannamedir. SWAT 8 haftalık canlılığı, eksojen sinyal, adipokine salgılanması ve engraftment bir hayvan modeli içine yanıt gösteren tarafından doğrulandı.

Protocol

Tüm görevler uyum içinde #8759 ve #9189, iletişim kuralları için gerçekleştirilen IRB Office LSUHSC-NO. tarafından onaylanmış Uyum içinde iletişim kuralı # LSUHSC-No IACUC ofiste tarafından onaylanmış 3285 için gerçekleştirilmiş tüm hayvan işleri 1. hücre sayfaları sandviç tohum Not: Bkz. Şekil 1. Tohum ADSCs, yaklaşık % 80’i confluency doku kültürü tabak (6 cm veya 6-şey tabak) içinde. 1 gele…

Representative Results

SWAT canlılığı başlangıçta bireysel WAT kümeleri seri aydınlık alan görüntüleme tarafından değerlendirildi (n = 12) yaklaşık 7.6 hafta içinde. Kümeleri güvenli monolayer bu süre boyunca üzerinde yerinde kaldı. Hafif morfolojik değişiklikler ile biraz çözgü veya konumları değişen bireysel adiposit gözlendi. Ancak, adipositler de zamanla dedifferentiation eksikliği gösteren multilocular haline, ne de herhangi bir görünür işaretleri hücresel blebbing, l…

Discussion

Bu iletişim kuralı sandviç insan beyaz yağ dokusu ADSCs kullanımına detayları; insan ADSC hücre hatları via köklü protokolleri15ayrılmış olabilir. Ancak, sistem (örneğin sandviç fare WAT hücrelere 3T3L-1 kullanarak) bireyselleştirilmiş araştırma gereksinimleri için adapte edilebilir. Bu işlem birincil insan dokusu işleme içerir. Standart güvenlik önlemlerini istihdam edilmelidir; insan doku (Örneğin, HIV, HepC) BSL-2 patojen işlemek. Sadece doğrudan bir lis…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar LSU Sağlık Bilimleri proje finanse Merkezi tarafından sağlanan kurumsal destek kabul etmek istiyorum.

Materials

10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2µm Syringe Filter Celltreat 229747
5mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75°C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

References

  1. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
  2. Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
  3. Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
  4. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
  5. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
  6. Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
  7. Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
  8. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
  9. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  10. . NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017)
  11. Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
  12. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
  13. Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  14. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  15. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  16. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  17. Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
  18. Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 – is it thermogenesis?. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).

Play Video

Cite This Article
Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

View Video