인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

Summary

흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

Abstract

흰색 adipose 조직 (WAT)은 무게와 매일 건강을 조절에 중요 한 역할을 한다. 아직도, 모두 충실 하 게 정리 지방 microenvironment 또는 2 주 이상 와트 생존을 연장 하지 사용할 수 있는 기본 문화 모델에 상당한 한계가 있다. 신뢰할 수 있는 주 문화 모델의 부족은 심각 하 게 와트 대사 및 약물 개발에 연구를 방해 한다. 이 위해 우리 와트 주 문화 라는 ‘SWAT’ (샌드위치 백색 지방 조직)에 대 한 새로운 플랫폼을 개발 하는 microphysiologic 시스템의 NIH의 표준 활용 있다. 우리는 지방이 많은 파생 된 stromal 세포 시트 사이 다진된 와트 클러스터 사이 여 adipocytes의 자연 력 극복. 이 구문에서 와트 샘플 가능한 이상 8 주 문화에 있다. 스와트 유지 그대로 ECM, 셀 연락처 및 물리적 압력 조건의 vivo에서 와트; 또한, 기동 강력한 transcriptional 프로필, 외 인 화학 신호 및 전체 조직 기능에 감도 유지 합니다. SWAT의 주 지방 문화, 재현성, 간단 하 고 효과적인 메서드를 나타냅니다. 잠재적으로, 그것은 와트 생리학, 병 태 생리학, 물질 대사, 및 제약 개발 연구에 대 한 광범위 하 게 적용 가능한 플랫폼입니다.

Introduction

지방 조직 미국¹$147 십억 $210 십억 사이 연간 직접 의료 비용 운반 비만의 주 기관 이다. 지방이 많은 직물의 축적은 또한 심장 질환, 2 형 당뇨병, 그리고 특정 유형의 암²등 죽음의 다른 주요 원인에 기여. 생체 외에서 문화 모델 대사 연구와 신약 개발을 위해 필수적입니다 하지만 지방이 많은 직물의 현재 연구 모델 주요 결함. Adipocytes, 부 력, 그리고 말기 분화 세포를 세포 문화 플라스틱에 고착 하지 않을 것 이다 따라서 기존의 셀 문화 방법을 사용 하 여 경작 될 수 없습니다. 1970 년대 이후, 여러 가지 방법이 사용 되었습니다 시도에서 유리 coverslips, 천장, 현 탁 액 문화, 문화와 세포 외 매트릭스^3,,45, 의 사용을 포함 하 여 이러한 장벽을 극복 하기 위해 ^{6 , 그러나 7}., 이러한 방법은 세포 죽음과 dedifferentiation, 의해 표시 된 하 고 그들은 2 주 연구 기간 보다 더 일반적으로 사용 됩니다. 또한,이 모델을 시도 하지 않는다 그들은 그대로 ECM을 유지 하지 않는, adipocytes 사이 고 stromal 상호 작용 지원 셀도 수축 힘 셀에 에서 vivo에서 발휘로 네이티브 지방 microenvironment 정리 와트.

골드 표준 기본 지방 문화 방법의 부재, 지방 연구는 차별화 된 사전 adipocytes (diffAds)에 주로 의존 했다. DiffAds multilocular, 부착, 그리고 metabolically 활성 있습니다. 대조적으로, 기본 흰색 adipocytes 단원제의 nonadherent, 그리고 상대적으로 낮은 신진 대사를 보여 줍니다. 건강 한 성숙 지방 조직 생리학 정리 현재 지방 문화 모델의 실패 가능성이 FDA 승인 약품을 직접 대상으로 adipocytes의 부재에 주요 요인입니다. 사실, 기관 모델 physiologic 생체 외에서 부족 대부분 장기 및 질병에서 중요 한 문제입니다.

Microphysiological 시스템 (MPS) 프로그램의 생성을 발표의 위치 종이, 국립 보건원 (NIH) 모든 인간의 제약 임상 시험 통해 2013 성공률은만 18 단계 II에 대 한 %와 50% 단계 III에 대 한 보고 임상 시험⁸. MPS 프로그램은 직접 모델 인간의 생리를 생체 외에서 monoculture의 무 능력을 해결 하기 위해 설계 되었습니다. NIH 문화 시스템 인간의 기본 또는 기관 기능 정리 다세포 3D 구문에서 줄기 세포의 구성으로 MPSs를 정의 합니다. 균질, 불멸 하 게 한 세포 배양의 reductionist 모델과 달리 MPSs-셀, 마약 셀, 약물-약물, 및 장기 약물 상호 작용⁹모델 정확 하 게 한다. 단기 주 문화 메서드와 달리 NIH 기준 MPS 지속 문화⁸에서 4 주 이상 지정합니다. MPS 프로그램의 자세한 내용은 NIH의 댓글은 (#RFA-엉-18-001)¹⁰에서 찾을 수 있습니다.

우리 간단 하 게, 소설, 적응력, 개발 하 고 저렴 한 지방 의원 “백색 지방 조직에 끼여” 되 나 (기동)¹¹. 우리는 지방이 많은 파생 된 stromal 세포 (줄기) (그림 1) 시트 사이 “붙여” 다진된 기본 지방 조직으로 adipocytes의 자연 력 극복. 결과 3D 구조 셀 연락처 및 네이티브 지방 microenvironment 자연 체형 지원 세포 인구를 가진 성숙한 adipocytes 주변으로. 스와트 8 주 생존, exogenous 신호, adipokine 분 비, 및 동물 모델로 engraftment 응답으로 검증 되었습니다.

Protocol

LSUHSC-NO. IRB 사무실에 의해 승인 된 프로토콜 #8759 #9189, 준수 모든 작업 수행 했다 모든 동물 작품 프로토콜 #3285 IACUC 사무실 LSUHSC-호에 의해 승인 준수에서 수행 되었다 1. 셀 시트 끼우기의 시드 참고: 그림 1을 참조 하십시오. 씨 줄기 조직 문화 접시 (6 cm 또는 6 잘 플레이트)에 약 80 %confluency. 스와트 원하는 각 잘 잘 1 기존의 ?…

Representative Results

SWAT의 처음 개별 와트 클러스터의 직렬 명시 화상 진 찰에 의해 평가 되었다 (n = 12) 약 7.6 주 동안. 클러스터에이 시간에 걸쳐 단층에 보안 남아 있었다. 약간의 형태학 상 변화는 개별 adipocytes 약간 휘게 하거나 위치 이동으로 관찰 되었다. 그러나, adipocytes도 될 multilocular 시간이 지남에 dedifferentiation의 부족을 나타내는 그들은 셀룰러 blebbing, 세포, 또는 조각화 (<strong class="x…

Discussion

이 프로토콜 세부 샌드위치 인간의 흰색 adipose 조직; 줄기를 사용 하 여 인간의 ADSC 셀 라인 잘 설립 프로토콜¹⁵를 통해 격리 된 수 있습니다. 그러나, 시스템 (3T3L-1 셀 샌드위치 마우스 와트를 사용 하 여) 등 개별된 연구 요구 사항에 맞게 수 있습니다. 이 프로세스는 기본 인간의 조직 처리 해야 합니다. 표준 안전 예방 조치를 고용 한다; 인간의 조직 BSL-2 병원 체 (예: HIV, He…

Materials

10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatin	Sigma-aldrich	G9391
Collagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosine	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Media	Thermofisher	11043023	Phenol red-free
250µm Mesh Filter	Pierce	87791
0.2µm Syringe Filter	Celltreat	229747
5mL Luer-Lok syringes	BD	309646
Metal Washers			These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g
Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker	VWR	10020-988	Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block			Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath			Set to ~75°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus			These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics