Nanoparticle-gemedieerde siRNA Gene-zwijgen in volwassen Zebrafish hart
Summary
Het blijft een grote uitdaging om voorwaardelijke gen-knock-out of effectief gen-knockdown in volwassen zebrafish organen. Wij rapporteren hier een protocol voor presterende nanoparticle-gemedieerde siRNA gen-zwijgen in volwassen zebrafish hart, waardoor een nieuwe methode van het verlies-van-functie voor het bestuderen van volwassen organen in zebrafish en andere modelorganismen.
Abstract
Zoogdieren hebben een zeer beperkte capaciteit om te regenereren het hart na een myocardinfarct. Aan de andere kant, regenereert de volwassen zebrafish het hart na apex resectie of cryoinjury, waardoor het een belangrijk model-organisme voor hart regeneratie studie. Echter heeft het gebrek aan verlies-van-functie methoden voor volwassen organen beperkt inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de regeneratie van het hart. RNA-interferentie via verschillende afgiftesystemen is een krachtig hulpmiddel voor silencing genen in zoogdiercellen en modelorganismen. Eerder hebben we gemeld dat siRNA ingekapseld nanodeeltjes succesvol invoeren van cellen en leiden een opmerkelijke gen-specifieke knockdown regeneratie volwassen zebrafish middenin tot. Hier presenteren we een eenvoudige, snelle en efficiënte protocol voor de levering van Dendrimeer-gemedieerde siRNA en gen-zwijgen in de verkwikkende volwassen zebrafish hart. Deze methode biedt een alternatieve benadering voor het bepalen van de functies van het gen in volwassen organen in zebrafish en kan worden uitgebreid tot andere modelorganismen als goed.
Introduction
Myocardinfarct is uitgegroeid tot een grote gezondheidsbedreiging, wat leidt tot een enorme economische last rond de wereld1. De volwassen zoogdieren hart niet regenereren en vullen de verloren cardiomyocytes op macroscopische schaal na de verwonding, wat leidt tot de vorming van het litteken weefsels en latere hartfalen. In tegenstelling tot zoogdieren is de zebravis hart regeneratie, voornamelijk door de robuuste myocardiale proliferatie na verschillende soorten hart schade, waardoor het een ideale modelorganisme voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen van hart regeneratie mogelijk 2,3,4,5,6,7,8. Ontcijferen van de endogene mechanismen is onderliggende zebrafish hart regeneratie een spannende gebied van onderzoek in de zoektocht naar nieuwe therapeutische strategieën ter verbetering van menselijk hart regeneratie9.
Genetische manipulatie methoden zijn beschikbaar in zebrafish. Deze bestaan uit morpholinos (MO), die ook op grote schaal worden gebruikt in kikkers, kuiken, en zoogdieren naast in zebrafish10,11,12,13. MO heeft efficiënte knockdown van doel genexpressie in de volwassen zebrafish fin, de hersenen en het netvlies14,15,16,17,18,19. Vergrendeld-nucleic zuur (LNA) is een andere kunstmatige oligonucleotide gebruikt voor het neerhalen van endogene genexpressie niet alleen in zebrafish embryo’s, maar ook in volwassen dierlijke organen20,21,22, 23 , 24. het ontbreken van effectieve methoden van de verlies-van-functie voor volwassenen hart blijft echter een obstakel bij het bestuderen van de moleculaire mechanismen van orgel regeneratie. Bij de huidige, kleine-molecuul remmers of transgene expressie van dominant-negatieve mutanten worden voornamelijk gebruikt voor het blokkeren van de functie van een bepaald gen of traject te bestuderen zijn functie in de volwassen zebrafish hart regeneratie25,26 ,27. Echter niet alle genen of signaalroutes gelden voor deze methoden.
Kleine-inmenging RNAs (siRNAs) worden veel gebruikt voor de analyse van de verlies-of-function in zoogdiercellen en embryo’s van modelorganismen, evenals volwassen organen voor preklinische studies in dierlijke modellen28,29,30 , 31 , 32. siRNAs zijn effectief gebruikt om genen in tumoren33,34,35 en in cardiomyocytes36,37,38,39 zwijgen ,40 via verschillende levering systemen. Onlangs, ontwikkelden we efficiënte siRNA ingekapseld nanoparticle gen-zwijgen in de verkwikkende volwassen hart met behulp van verscheidene verschillende nanodeeltjes41,42,43, die een nieuwe tool voor bieden: functionele studies van genen in volwassen zebrafish organen. Gebaseerd op onze eerdere studies41,42,43, presenteren hier wij een eenvoudige, praktische, maar krachtige protocol voor siRNA gen-zwijgen in de verkwikkende volwassen zebrafish hart met behulp van de f-PAMAM-PEG-R9 dendrimeren. Aldh1a2 (aldehyde dehydrogenase 1, familielid A2) gene was upregulated na zebrafish apex resectie en ablatie van Aldh1a2 geblokkeerd de cardiale regeneratie44. Hier nemen we aldh1a2 gen als een voorbeeld voor het testen van de gene vechtpartij efficiëntie gemedieerd door nanoparticle-ingekapseld siRNA injectie. Dit protocol bevat een procedure voor de zebravis hart resectie, chemische synthese van nanodeeltjes en een leveringsmethode op siRNA ingekapseld nanodeeltjes in volwassen zebrafish hart.
Protocol
Representative Results
Discussion
De zebravis is volledig geschikt voor het regenereren van allerlei organen, inclusief de volwassen hart5. Terwijl transgene en genetische methoden goed ontwikkelde zijn voor het bestuderen van functies van het gen in de embryo’s van zebravis, worden onderzoekers nog steeds geconfronteerd met de lastige taak van het genereren van voorwaardelijke mutant allelen in zebrafish45,46. Dus, transgene dominant-negatieve mutanten of kleine-molecuul …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. IC Bruce voor kritische opmerkingen en het lezen van het manuscript. Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 en 31521062), de AstraZeneca Azië, en de opkomende markt innovatieve geneeskunde en de vroege ontwikkeling.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2′-4′ conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2′,4′-(N-methoxy)aminomethylene and 2′,4′-aminooxymethylene and 2′-O,4′-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2′,4′-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing’s sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
