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发育生物学

SiRNA de nanoparticule-mediated Gene silencing coeur de poisson-zèbre adulte

Published: July 29, 2018
doi:
10.3791/58054
, , , , ,
1Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Institute of Molecular Medicine,Peking University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering,Peking University

Summary

Il reste un défi majeur pour développer conditionnelle gène-knockdown gène-masquage ou efficace dans les organes de poisson-zèbre adulte. Nous rapportons ici un protocole pour exécutante siARN médiée par les nanoparticules gène-baffle en coeur de poisson-zèbre adulte, fournissant ainsi une nouvelle méthode de perte de fonction pour l’étude des organes adultes dans le poisson-zèbre et autres organismes modèles.

Abstract

Les mammifères ont une capacité très limitée pour régénérer le coeur après infarctus du myocarde. En revanche, le poisson-zèbre adult régénère son cœur après résection de l’apex ou cryoinjury, ce qui en fait un organisme modèle important pour l’étude de la régénération cardiaque. Toutefois, le manque de méthodes de perte de fonction d’organes adultes a limité à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la régénération cardiaque. L’interférence ARN via différents vecteurs est un outil puissant pour faire taire des gènes dans les cellules de mammifères et des organismes modèles. Nous avons déjà rapporté que nanoparticules siARN encapsulé avec succès entrer dans les cellules et entraînent un knockdown de gène-spécifique remarquable au coeur de poisson-zèbre adulte en régénération. Nous présentons ici un protocole simple, rapid et efficace pour la médiation dendrimère ARNsi et gène-baffle en plein coeur de poisson-zèbre adulte en régénération. Cette méthode fournit une autre méthode pour déterminer la fonction des gènes dans les organes adultes chez le poisson zèbre et peut être étendue à d’autres organismes de modèle aussi bien.

Introduction

L’infarctus du myocarde est devenu une menace de santé majeur, conduisant à un énorme fardeau économique autour du monde1. Le cœur des mammifères adult ne parvient pas à se régénérer et reconstituer les cardiomyocytes perdues sur une échelle macroscopique après la blessure, conduisant à la formation de tissus cicatriciels et une insuffisance cardiaque subséquente. Contrairement aux mammifères, le poisson-zèbre est capable de régénération de coeur, principalement par le biais de la prolifération du myocarde robuste après les différents types de lésion cardiaque, ce qui en fait un organisme modèle idéal pour étudier les mécanismes moléculaires de régénération de coeur 2,3,4,5,6,7,8. Décrypter les mécanismes endogènes sous-jacent régénération de coeur de poisson-zèbre est un domaine passionnant de recherche dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques améliorer la régénération de coeur humain9.

Il existe des méthodes de manipulation génétique chez le poisson zèbre. Il s’agit de morpholinos (MO) qui sont également largement utilisés dans les grenouilles, Poussin et les mammifères en plus dans le poisson-zèbre10,11,12,13. MO a précipitation efficace d’expression des gènes cible dans la nageoire de poisson-zèbre adulte, le cerveau et la rétine14,15,16,17,18,19. L’acide nucléique verrouillé (LNA) est un autre oligonucléotide artificielle utilisée pour abattre l’expression des gènes endogènes non seulement dans des embryons de poisson-zèbre, mais aussi dans des organes animaux adultes20,21,22, 23 , 24. Cependant, l’absence de méthodes efficaces de perte de fonction pour les coeurs des adultes demeure un obstacle dans l’étude des mécanismes moléculaires de la régénération de l’orgue. À présents, petites molécules inhibiteurs ou expression transgénique de mutants dominants négatifs sont principalement utilisés pour bloquer la fonction d’un gène ou une voie d’étudier sa fonction dans le poisson-zèbre adulte coeur régénération25,26 ,,27. Cependant, tous les gènes ou les voies de signalisation sont applicables pour ces méthodes.

Petit-interférant RNAs (siARN) sont largement utilisés pour l’analyse de la perte de fonction dans les cellules de mammifères et d’embryons des organismes modèles, ainsi que des organes adultes pour des études précliniques chez animal modèles28,29,30 , 31 , 32. siARN ont été utilisés efficacement pour réduire au silence des gènes dans les tumeurs33,34,35 et dans les cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 par l’intermédiaire de différents vecteurs. Récemment, nous avons développé efficace encapsulé siARN NANOPARTICULE-silençage génique en plein adulte régénérant à l’aide de plusieurs différentes nanoparticules41,42,43, fournissant un nouvel outil pour études fonctionnelles des gènes dans les organes de poisson-zèbre adulte. D’après nos précédentes études41,42,43, nous présentons un protocole simple, pratique et puissant pour les siARN gène-baffle en plein coeur de poisson-zèbre adulte régénérant à l’aide de f-PAMAM-PEG-R9 dendrimères. Aldh1a2 (aldéhyde déshydrogénase 1, membre de la famille A2) gène a augmenté après résection d’apex de poisson-zèbre et ablation des Aldh1a2 bloqué la régénération cardiaque44. Ici nous prenons aldh1a2 gène par exemple pour tester l’efficacité défiant gène médiée par injection de siARN nanoparticules encapsulées. Ce protocole prévoit une procédure pour résection de coeur de poisson-zèbre, la synthèse chimique des nanoparticules et une méthode de livraison sur les nanoparticules de siARN encapsulé dans le coeur de poisson-zèbre adulte.

Protocol

Toutes les procédures animales utilisé un protocole de poisson-zèbre approuvé par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Pékin, qui est entièrement accrédité par Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care et d’institutionnels animalier. 1. préparation de la Solution de tricaïne Pour préparer la solution mère de tricaïne, ajouter 400 mg éthyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate de poudre à 97,9 mL d’eau distillée et ajouter ensu…

Representative Results

Pour déterminer l’efficacité de la médiation dendrimère ARNsi, nous réséqué l’apex du ventricule du coeur zebrafish, puis injecté environ 10 µL de dendrimer seulement (groupe fictif), Cy5-siARN seulement (groupe nu) ou f-PAMAM-PEG-R9 dendrimère-encapsulés Intrapleurale Cy5-siARN (groupe Cy5-siARN), respectivement (Figure 2A-B). Le signal de fluorescence a été détecté dans les coeurs injectés avec dendrimère-encapsulés Cy…

Discussion

Le poisson-zèbre est tout à fait capable de régénérer des divers organes dont le coeur adulte5. Tandis que les méthodes transgéniques et génétiques sont bien développés pour l’étude des fonctions des gènes chez les embryons de poisson-zèbre, enquêteurs sont toujours confrontés à la lourde tâche de générer des allèles mutants conditionnels dans le poisson-zèbre45,46. Ainsi, des mutants transgéniques dominant négati…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Dr IC Bruce d’observations critiques et la lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 et 31521062), en Asie de AstraZeneca et émergents marché médecine innovatrice et développement précoce.

Materials

tricaine Sigma E10521 Store at 4°C
stereomicroscope Leica  S8AP0
sharp forcep WPI 14098
iridectomy scissors WPI 501778
elbow tweezers Suzhou Liuliu SE05Cr
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) Biomatrik (Jiaxing) Inc. 5239
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) Andrews ChemServices AuCS-297
vacuum drying equipment Yiheng DZF-6020
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) Alfar Aesar 51805-45-9 Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.
ultrafiltration tube Millipore UFC900308
freeze dryer Martin Christ Alpha 2-4 Ldplus
NMR spectrometer Bruker AV400
Deuterium oxide(D2O) J&K 174611
NMR sample tube J&K WG-1000-7-50
3 kDa MWCO ultrafiltration tube Merck UFC900308
sea salts Instant Ocean® SS15-10
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Keywords: NanoparticleSiRNAGene-silencingZebrafishHeart RegenerationVentricular ResectionPAM Nanoparticle DendrimerALDH1A2 SiRNAScrambled Negative Control SiRNACyanine DyesAnesthesiaSurgeryRecovery
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Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu, X., Luo, Y., Xiong, J. Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (137), e58054, doi:10.3791/58054 (2018).
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