ナノ粒子を介した siRNA 遺伝子サイレンシング アダルト ゼブラフィッシュ心臓で
Summary
条件遺伝子ノックアウトまたは効果的な遺伝子ノックダウン アダルト ゼブラフィッシュ臓器を開発する主要な課題が残った。ここで実行するナノ粒子を介したの siRNA 遺伝子-サイレンシング アダルト ゼブラフィッシュ心臓、ゼブラフィッシュと他のモデル有機体の大人の臓器を研究するための新しい機能喪失メソッドを提供するためのプロトコルを報告します。
Abstract
哺乳類は、心筋梗塞後、心臓を再生成する非常に限られた能力を持っています。その一方で、大人のゼブラフィッシュは尖切除または cryoinjury、それに心臓再生研究のための重要なモデル有機体の後その心を再生成します。ただし、大人の臓器機能の喪失方法の欠如は、心臓再生のメカニズムへの洞察力を制限されています。別の配信システムを介して RNA 干渉は、哺乳類細胞やモデル生物の遺伝子を黙らせるための強力なツールです。SiRNA でカプセル化されたナノ粒子は正常にセルを入力し、再生アダルト ゼブラフィッシュ中心部に顕著な特定遺伝子ノックダウンの結果について報告しました。再生アダルト ゼブラフィッシュ中心に siRNA のデンドリマーを介した配信ならびに遺伝子サイレンシングのシンプル、迅速、かつ効率的なプロトコルを紹介します。このメソッドは、ゼブラフィッシュの大人の臓器の遺伝子機能を決定するための代替アプローチを提供し、同様に他のモデル生物に拡張することができます。
Introduction
心筋梗塞世界の1のまわりの途方もない経済的負担につながる、主要な健康の脅威となっています。大人の哺乳類の心臓は再生成し、瘢痕組織とその後心不全の形成につながる外傷後巨視的スケールで失われた心筋細胞を補充するために失敗します。哺乳類とは異なり、ゼブラフィッシュは主に心臓の損傷、それにの心臓再生の分子メカニズムを調査するための理想的なモデル生物の種類ごとに堅牢な心筋拡散を通じて、心を再生できます。2,3,4,5,6,7,8。内因性メカニズムの解明の基になるゼブラフィッシュの心臓再生は人間の心の再生の9を改善する新しい治療戦略の検索で研究のエキサイティングな領域です。
ゼブラフィッシュ遺伝子操作方法があります。これらは、カエル、ひよこ、ゼブラフィッシュ10、11,12,13以外の哺乳類でも広く使用されている morpholinos (MO) で構成されます。MO は、大人ゼブラフィッシュ フィン、脳、網膜14,15,16,17,18,19ターゲット遺伝子発現の効率的なノックダウン。ロックされた核酸酸 (LNA) はゼブラフィッシュ胚のみならず大人動物臓器20,21,22,の内因性遺伝子の発現をノックダウンする使用別の人工オリゴヌクレオチド23,24します。 ただし、大人の心のための効果的な機能喪失方法の欠如のまま臓器再生の分子メカニズムを勉強中の障害物。現在、低分子阻害剤やドミナント ネガティブ変異体の遺伝子組換え発現で、主に特定の遺伝子やアダルト ゼブラフィッシュ心臓再生25,26 でその機能を勉強する経路の機能をブロックに使用します。 ,27。ただし、いないすべての遺伝子やシグナル伝達経路はこれらのメソッドに適用されます。
小さい干渉の Rna (Sirna) に広く哺乳類細胞および胚モデル生物だけでなく、大人の臓器の機能喪失における前臨床試験動物モデルの28,29,30,31,32. 沈黙遺伝子腫瘍33,34,35心筋36,37,38,39 に Sirna を効果的に使用されています。 ,40 別の配信システムを使用します。最近では、開発した効率的な siRNA でカプセル化されたナノ粒子はいくつか異なるナノ粒子41,42,43, を使用して再生の成人の心臓の遺伝子サイレンシングの新しいツールを提供します。アダルト ゼブラフィッシュ臓器における遺伝子の機能解析。私たち以前研究41,42,43に基づいて、ここでは提示 siRNA 遺伝子-サイレンシング f PAMAM-ペグ R9 を使用して再生アダルト ゼブラフィッシュ心臓のための実用的なシンプルで強力なプロトコルデンドリマー。Aldh1a2(アルデヒド脱水素酵素 1 家族、メンバー A2) ゼブラフィッシュ尖切除後亢進していた遺伝子とAldh1a2のアブレーション ブロック心筋再生44。ここでは、siRNA のナノ粒子カプセル注入による遺伝子ノックダウン効率をテストするための例としてaldh1a2遺伝子を取る。このプロトコルには、アダルト ゼブラフィッシュ心臓にゼブラフィッシュ心臓切除、ナノ粒子の化学合成 siRNA でカプセル化されたナノ粒子の配信方法の手順が含まれています。
Protocol
すべて動物のプロシージャには、動物介護制度と評価・実験動物ケアの認定会の認定を受けて完全に北京大学利用委員会によって承認されたゼブラフィッシュ プロトコルが使用されます。 1 Tricaine 溶液の調製 Tricaine 原液を準備するには、97.9 蒸溜水に 400 mg エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸パウダーを追加し、1 M トリス (pH 9.5) 〜 7 の pH を調整するため?…
Representative Results
デンドリマーを介したによる siRNA デリバリーの効率を決定するには、我々 はゼブラフィッシュ心臓の心室の頂点を切除し、デンドリマーのみ約 10 μ L (モック グループ)、Cy5-siRNA だけ (裸グループ)、または f PAMAM ペグ R9 デンドリマー内包を注入Cy5 siRNA (Cy5 siRNA グループ) intrapleurally それぞれ (図 2の B)。蛍光信号が 3、24、および 48 ?…
Discussion
ゼブラフィッシュはさまざまな成人の心臓5を含む臓器を再生可能です。遺伝子と遺伝的メソッドがゼブラフィッシュの胚の遺伝子機能を勉強のためよく発達した中、捜査官がまだゼブラフィッシュ45,46で条件付き変異対立遺伝子の生成の困難な課題に直面します。したがって、遺伝子ドミナント ネガティブ変異体または低分子阻?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は批判的なコメントありがとう博士 IC ブルースと原稿を読んでします。この作品は、国家自然科学基金、中国の (31430059、31701272、31730061、81470399、および 31521062)、アストラゼネカ アジア、新興市場の革新的な医学、初期開発からの補助金によって支えられました。
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
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Cite This Article
Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu, X., Luo, Y., Xiong, J. Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (137), e58054, doi:10.3791/58054 (2018).