סינתזה ואפיון של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטידים וההספק עצמית
Summary
פרוטוקול לסינתזה של 1, 2-dithiolane ששינה פפטיד ואפיון המבנים סופרא מולקולרית הנובע פפטיד הרכבה עצמית.
Abstract
הדו ח מתמקד הסינתזה של קצה אמיני 1, 2-dithiolane שינוי עצמי וההספק פפטיד, אפיון וכתוצאה מכך התאספו עצמית מבנים סופרא מולקולרית. המסלול סינתטי מנצל מוצק-פאזי פפטיד סינתזה עם המושבים על-שרף של dithiolane מולקולה קודמן, 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl), את thioacetate בסיוע מיקרוגל deprotection של פפטיד אמיני לפני המחשוף הסופי של השרף להניב את 1, 2-dithiolane ששינה פפטיד. לאחר הטיהור ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) של פפטיד 1, 2-dithiolane, נגזר ליבת nucleating פפטיד Aβ הקשורים עם מחלת אלצהיימר, מוצג על פפטיד להרכיב עצמי לתוך סיבי עמילואיד קרוס-β. פרוטוקולים לאפיין את סיבי עמילואיד על ידי פורייה-ספקטרוסקופיית (FT-IR), קיווטות ספקטרוסקופיה (CD) במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מוצגים. השיטות של שינוי N-מסוף עם moiety 1, 2-dithiolane פפטידים עצמית וההספק מאופיין היטב עכשיו ניתן לסייר כמערכות מודל לפיתוח אסטרטגיות ההרכבה שלאחר השינוי ולחקור דינמי כימיה קוולנטיות על פפטיד סופרא מולקולרית nanofiber משטחים.
Introduction
הקשר הפפטידי חזקים ויוצרים כימיה מעורב פפטיד מוצק-שלב הסינתזה ולעשות היכולת לשלוט רצף באורך ו הלחנה של פפטידים בעצמם למבנים סופרא מולקולרית שדה חקר בכבדות. הגורמים לשלוט ולייצב את מבנים מורכבים עצמית פפטיד, כולל שרשרת הצד הסטריים אלקטרוסטאטיות, מימן, וכוחות אפקטים הידרופובי1, לשמש ערכה של כללי עיצוב. כמו המחקר לתוך אלה כללי עיצוב בסיסי ממשיך להתקדם, הצעד ההגיוני הבא בפפטיד כוללת הרכבה עצמית הרחבת המגוון של מבנים מבוססת על פפטיד ופונקציות. בעוד עצמית בהרכבת פפטידים נמצאים biomaterial רב-תכליתי נעשה בהם שימוש ביו יישומים רבים על-ידי כיוונון פפטיד רצף או מכלול התנאים2,3,4, הפיתוח של אסטרטגיות שינויים שלאחר ההרכבה פפטיד nanofibers5,6,7,8,9 נשאר אזור יחסית שאינו גלוי.
כימיה exchange ותיול דיסולפידי דינמי על פני השטח של מבנים סופרא מולקולרית היא אזור בעל פוטנציאל תשואה biomaterials חדש ופונקציונלי. שילוב של 1, 2-dithiolane moieties (בדרך כלל נגזרת של חומצה ליפואית (la) או חומצה asparagusic (aa)) דווחו ליפוזום מערכות10,11,12,copolymers בלוק13, וכן ארגון עוגנים משטחים14,15. במסמך זה, אנחנו מדווחים על סינתזה ואפיון של פפטיד עצמית וההספק המופק nucleating הליבה של פפטיד Aβ הקשורים עם מחלת אלצהיימר ששונתה ב קצה אמיני עם קבוצה פונקציונלית 1, 2-dithiolane16, 17. הסיבים סופרא מולקולרית וכתוצאה מכך עכשיו לשמש פלטפורמה ניסיוני ללמוד את תגובתיות דיסולפידי-exchange ותיול על פני השטח סופרא מולקולרית של סיבי עמילואיד18.
Protocol
1. סינתזה ולטיהור 1, 2-Dithiolane ששינה פפטיד סינתזה של קודמן dithiolane, 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl)19. להוסיף 1 גר’ 3-ברומו – 2-(bromomethyl) חומצה propionic (1 equiv.) מומס כמות מינימלית של NaOH M 1 (כ- 4 מ”ל) אל בקבוק התגובה התחתון עגול 25-mL עם ערבוב-55 מעלות צלזיוס. לאטום את הבקבוקון התגובה ?…
Representative Results
מלבד הסינתזה הראשונית של צעד אחד של מולקולה קודמן dithiolane, מתרחשת שאר הסינתזה פפטיד 1, 2-dithiolane שונה על תמיכה מלאה (איור 1 א’). ההמרה של 3-ברומו – 2-(bromomethyl) חומצה propionic 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl), מבשר dithiolane, אושר על ידי 1H ו- 13NMR C (איור 1B</strong…
Discussion
מאמר זה דן הפרטים של שניהם הסינתזה ו הטיהור של פפטיד עצמית וההספק 1, 2-dithiolane ששינה N-מסוף ואפיון של המבנים סופרא מולקולרית וכתוצאה מכך. הסינתזה של פפטיד 1, 2-dithiolane שדווחו פה יש את היתרונות, כולל סינתזה של צעד אחד כדי לייצר מבשר dithiolane, 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl), ו—השרף מיקרוגל deprotection התגובה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה תודה ד ר ב’ אלן Scanley שלה הדרכה טכנית ולעזור להשתמש TEM את מכללות מדינת קונטיקט ומרכז האוניברסיטה (CSCU) של ננו-טכנולוגיה, ד ר Ishita Mukerji באוניברסיטת מתה עבור גישה אל הדיסק שלה ספקטרופוטומטרים. העבודה שדווחה באופן חלקי נתמך על ידי המכון למדע באוניברסיטת פיירפילד, נאס א קונטיקט החלל מענק האיחוד, ועל -ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מספר צ’ה-1624774.
Materials
| Rink amide MBHA resin, high load | Gyros Protein Technologies | RAM-5-HL | Avoid contact with skin and eyes; do not inhale |
| N,N-Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | Flammable liquid and vapor; irritating to eyes and skin; Use personal protective equipment; keep away from open flame |
| Fmoc-L-Val-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-V | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Leu-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-L | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-KBC | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Phe-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-F | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Ala-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-A | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-QT | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate | Gyros Protein Technologies | 26432 | Causes skin, eye and respiratory irritation; do not inhale; use under hood or in well ventilated area |
| 0.4 M N-methylmorpholine in DMF | Gyros Protein Technologies | PS3-MM-L | highly flammable; wear personal protective equipment; keep away from heat and keep container tightly closed; do not inhale or swallow; wash skin thoroughly after handling |
| 20% piperidine in DMF | Gyros Protein Technologies | PS3-PPR-L | Causes severe eye and skin burns; Flammable Liquid and vapor; Do not inhale |
| dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | May cause cancer; Do not inhale; Wear personal protective equipment; use under hood only; if contacted rise with water for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | Flammable; irritating to eyes; Use personal protective equipment; Use only under a fume hood; keep away from open flame or hot surface; if contacted rinse wiith water for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | A116-50 | Causes severe burns; do not inhale; harmful to aquatic life; use personal protective equipment; use only under fume hood; if contacted rinse with water for at least 15 minutes and obain immediate medical attention |
| 4% uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-4 | Do not inhale; harmful to aquatic life |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Acros Organics | AC172571000 | Do not inhale; use outdoors or in well-ventilated area |
| nitrogen Gas | TechAir | Contents under pressure, may explode if heated | |
| 3-bromo-2-(bromomethyl)propionic acid | Alfa Aesar | AAA1963014 | Do not inhale; causes irritation to skin and eyes; corrosive |
| sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Use personal protective equipment; use only under fume hood; if contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| potassium thioacetate | Acros Organics | AC221300250 | Causes skin and eye irritation; do not inhale; use personal protective equipment |
| sulfuric acid | Fisher Scientific | SA213 | Causes burns; keep away from water; keep away from combustible material; do not inhale; use personal protective equipment; if contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | Possible cancer hazard; irritating to skin and eyes; do not inhale; Use personal protective equipment; use only under fume hood; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | Possible cancer hazard; irritating to skin and eyes; do not inhale; Use personal protective equipment; use only under fume hood; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| N,N-diisopropylethylamine | Acros Organics | AC367841000 | Highly flammable; harmful to aquatic life; wear personal protective equipment; do not swallow |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Corrosive; do not inhale |
| methanol | Fisher Scientific | A452-4 | Flammable liquid and vapor; use personal protective equipment; do not inhale; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781 | Flammable; use personal proctective safety equipment; keep container tightly closed |
| diethyl ether | Fisher Scientific | E138-1 | Extremely flammable; Irritating to skin and eyes; Use personal protective equipment |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich | 39319-10x10MG-F | do not inhale; irritating to skin and eyes |
| alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Alfa Aesar | AAJ67635EXK | |
| c18 zip-tip | Millipore | ZTC18S096 | |
| tris(2-carboxyethyl) phospine hydrochloride | Thermo Scientific | PI20490 | |
| silica gel 60 F254 coated aluminum-backed TLC sheets | EMD Millipore | 1.05549.0001 | |
| Thin walled Precision NMR tubes | Bel-Art | 663000585 | 5mm O.D. |
| All-plastic Norm-Ject syringes | Air Tite | AL10 | |
| single-use needle | BD PrecisionGlide | BD 305185 | used needles get disposed on in sharps waste container |
| disposable fritted syringe | Torviq | SF1000LL | 10mL fritted syringes were used in the report, but larger syringes are avaibale if needed for larger scale synthesis. |
| carbon grid | Ted Pella, Inc. | CF200-CU | Make sure to prepare samples and staining on the carbon grid side, not the shiny copper side of grid |
| self-closing tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78318-3X | very sharp tips, length: 120 mm |
| 0.1 mm short path length cell | Starna Cells, Inc. | 20/C-Q-0.1 | Fragile |
| 10mL Vessel Caps | CEM | 909210 | |
| 10mL Pressure Vessels | CEM | 908035 | |
| Aeris Semi-Prep HPLC column | Phenomenex | 00F-4632-N0 | 150 x 10mm |
| cell holder | Starna Cells, Inc. | CH-2049 | Needed when using short pathlength cells |
| PS3 peptide synthesizer | Gyros Protein Technologies | ||
| DiscoverSP Microwave Reactor | CEM | ||
| centrifuge | HERMLE | Z 206 A | used a fixed 6×50 mL rotor |
| HPLC | Shimadzu | UV Detector | |
| nuclear magnetic resonance spectrometer | Avance, Bruker | 300 MHz | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Axima Confidence, Shimadzu | ||
| lyophilizer | Millrock Technology | BT85A | |
| Fourier-Transform Infrared Spectrometer | Alpha Tensor, Bruker | ||
| Transmission Electron Microscope | Tecnai Spirit, FEI | Used with Gatan Orius Fiberoptic CCD digital camera. Accessed at CSCU Center for Nanotechnology | |
| Circular Dichroism Spectropolarimeter | J-810, JASCO | Used with a six-cell Peltier temperature controller. Accessed at Wesleyan University. |
References
- Wang, J., Liu, K., Xing, R., Yan, X. Peptide self-assembly: Thermodynamics and kinetics. Chemical Society Reviews. 45, 5589-5604 (2016).
- Dong, R., et al. Functional supramolecular polymers for biomedical applications. Advanced Materials. 27, 498-526 (2015).
- Edwards-Gayle, C. J. C., Hamley, I. W. Self-assembly of bioactive peptides, peptide conjugates, and peptide mimetic materials. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5867-5876 (2017).
- Goor, O. J. G. M., Hendrikse, S. I. S., Dankers, P. Y. W., Meijer, E. W. From supramolecular polymers to multi-component biomaterials. Chemical Society Reviews. 46, 6621-6637 (2017).
- DiMaio, J. T. M., Doran, T. M., Ryan, D. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Modulating supramolecular peptide hydrogel viscoelasticity using biomolecular recognition. Biomacromolecules. 18, 3591-3599 (2017).
- DiMaio, J. T. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Display of functional proteins on supramolecular peptide nanofibrils using a split-protein strategy. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5279-5283 (2017).
- Mahmoud, Z. N., Gunnoo, S. B., Thomson, A. R., Fletcher, J. M., Woolfson, D. N. Bioorthogonal dual functionalization of self-assembling peptide fibers. Biomaterials. 32, 3712-3720 (2011).
- Petkau-Milroy, K., Uhlenheuer, D. A., Spiering, A. J. H., Vekemans, J. A. J. M., Brunsveld, L. Dynamic and bio-orthogonal protein assembly along a supramolecular polymer. Chemical Science. 4, 2886-2891 (2013).
- Li, A., et al. Neurofibrillar tangle surrogates: Histone H1 binding to patterned phosphotyrosine peptide nanotubes. 生物化学. 53, 4225-4227 (2014).
- Sadownik, A., Stefely, J., Regen, S. L. Polymerized liposomes formed under extremely mild conditions. Journal of the American Chemical Society. 108, 7789-7791 (1986).
- Zhang, N., et al. ATN-161 Peptide functionalized reversibly cross-linked polymersomes mediate targeted doxorubicin delivery into melanoma-bearing C57BL/6 mice. Molecular Pharmaceutics. 14, 2538-2547 (2017).
- Margulis, K., et al. Formation of polymeric nanocubes by self-assembly and crystallization of dithiolane-containing triblock copolymers. Angewandte Chemie International Edition. 56, 16357-16362 (2017).
- Zhang, X., Waymouth, R. 1,2-Dithiolane-Derived Dynamic, Covalent Materials: Cooperative Self-Assembly and Reversible Cross-Linking. Journal of the American Chemical Society. 139, 3822-3833 (2017).
- Sakia, N., Matile, S. Stack exchange strategies for the synthesis of covalent double-channel photosystems by self-organizing surface-initiated polymerization. Journal of the American Chemical Society. 133, 18542-18545 (2011).
- Uji, H., Morita, T., Kimura, S. Molecular direction dependence of single-molecule conductance of a helical peptide in molecular junction. Physical Chemistry Chemical Physics. 15, 757-760 (2013).
- Liang, C., Ni, R., Smith, J. E., Childers, W. S., Mehta, A. K., Lynn, D. G. Kinetic intermediates in amyloid assembly. Journal of the American Chemical Society. 136, 15116-15149 (2014).
- Smith, J. E., et al. Defining the dynamic conformational network of cross-β peptide assembly. Israel Journal of Chemistry. 55, 763-769 (2015).
- Black, S. P., Sanders, J. K. M., Stefankiewicz, A. R. Disulfide exchange: Exposing supramolecular reactivity through dynamic covalent chemistry. Chemical Society Reviews. 43, 1861-1872 (2014).
- Vendetti, A., et al. Dihydroasparagusic acid: Antioxidant and tyrosinase inhibitory activities and improved synthesis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 6848-6855 (2013).
- Stawikowski, M., Fields, G. B. Introduction to peptide synthesis. Current Protocols in Protein Science. 26, (2002).
- Canadell, J., Goossens, H., Klumperman, B. Self-healing materials based on disulfide links. Macromolecules. 44, 2536-2541 (2011).
- Lafont, U., van Zeijl, H., van der Zwaag, S. Influence of cross-linkers on the cohesive and adhesive self-healing ability of polydisulfide-based thermosets. ACS Applied Materials and Interfaces. 4, 6280-6288 (2012).
- Komaromy, D., Stuart, M. C. A., Santiago, G. M., Tezcan, M., Krasnikov, V. V., Otto, S. Self-assembly can direct dynamic covalent bond formation toward diversity or specificity. Journal of the American Chemical Society. 139, 6234-6241 (2017).
- McAvery, K. M., Guan, B., Fortier, C. A., Tarr, M. A., Cole, R. B. Laser-induced oxidation of cholesterol observed during MALDI-TOF mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 659-669 (2011).
- Krimm, S., Bandekar, J. Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins. Advances in Protein Chemistry. 38, 181-364 (1986).
- Halverson, K. J., Sucholeiki, I., Ashburn, T. T., Lansbury, P. T. Location of β-sheet-forming sequences in amyloid proteins by FTIR. Journal of the American Chemical Society. 113, 6701-6703 (1991).
- Greenfield, N., Fasman, G. D. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein confirmation. 生物化学. 8, 4108-4116 (1969).
- . ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2016)
- Roy, S., Shinde, S., Hamilton, G. A., Hartnett, H. E., Jones, A. K. Artificial [FeFe]-hydrogenase: On resin modification of an amino acid to anchor a hexacarbonyldiiron cluster in a peptide framework. European Journal of Inorganic Chemistry. 2011, 1050-1055 (2011).
- Van Duinen, S. G., Castano, E. M., Prelli, F., Bots, G. T. A. B., Luyendijk, W., Frangione, B. Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis in patients of Dutch origin is related to Alzheimer disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 5991-5994 (1987).
- Barth, A. The infrared absorption of amino acid sidechains. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 74, 141-173 (2000).
- Jayaraman, M., et al. Slow amyloid nucleation via α-helix-rich oligomeric intermediates in short polyglutamine-containing Huntingtin fragments. Journal of Molecular Biology. 415, 881-899 (2012).
Cite This Article
Neves, R., Stephens, K., Smith-Carpenter, J. E. Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides. J. Vis. Exp. (138), e58135, doi:10.3791/58135 (2018).