מדידת ריכוז יון בשכבת הגבול Unstirred עם תיקון פתוח-קלאמפ פיפטה: השלכות בשליטה של תעלות יונים על ידי נוזל לזרום
Summary
תעלות יונים Mechanosensitive נלמדים לעתים קרובות במונחים של זרימת נוזלים/הטיה רגישות כוח עם תיקון-קלאמפ הקלטה. עם זאת, בהתאם לפרוטוקול ניסיוני, התוצאה על זרימת נוזלים-תקנות של תעלות יונים יכול להיות מוטעים. כאן, אנו מספקים שיטות מניעת ותיקון שגיאות כאלה עם בסיס תיאורטי.
Abstract
זרימת נוזלים היא גירוי סביבתי חשוב השולט תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון vasodilation הנוצרות על-ידי זרימת נוזלים. למרות המנגנון המולקולרי אחר התגובות זרימת נוזל/הטיה כוח ביולוגי אינם מובנים במלואם, רגולציה בתיווך זרימת נוזל של יון ערוץ gating יכול לתרום באופן ביקורתי. לכן, זרימת נוזל/הטיה הרגישות בכוח של תעלות יונים נחקרה בטכניקה תיקון-קלאמפ. עם זאת, בהתאם לפרוטוקול ניסיוני, תוצאות ופרשנות של נתונים יכול להיות מוטעים. כאן, אנו מציגים ראיות ניסיוני ותיאורטי עבור שגיאות הקשורות זרימת נוזל מספקים שיטות להערכת, מניעת של תיקון שגיאות אלה. שינויים בצומת פוטנציאלי בין אלקטרודה הפניה Ag/AgCl נוזל רחצה נמדדו עם פיפטה פתוח מלא עם 3 מ’ אשלגן כלורי. זרימת נוזלים יכול ואז shift mV פוטנציאליים כדי כ 7 את צומת נוזלי/מתכת. לעומת זאת, על ידי מדידת משמרת מתח הנגרמת על ידי זרימת נוזלים, אנחנו מעריכים את ריכוז יון בשכבת הגבול unstirred. במצב סטטי, ריכוז יון האמיתי סמוך Ag/AgCl הפניה אלקטרודה או יון הערוץ לים על פני קרום התא יכול להגיע נמוך כמו כ- 30% זה מצב זרימה. הנחת agarose של 3 מ’ אשלגן כלורי גשר בין האלקטרודה נוזל והפניה רחצה עשוי למנוע את הבעיה של צומת פוטנציאלי הסטה. עם זאת, האפקט שכבה unstirred סמוך פני קרום התא לא היתה אפשרות לתקן בדרך זו. כאן, אנו מספקים שיטה למדידת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred עם פיפטה תיקון פתוח-קלאמפ, המדגיש את החשיבות של שימוש agarose של מלח-גשר תוך כדי לימוד תקנה הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים יון. לכן, גישה חדשנית זו, אשר לוקח בחשבון את ריכוזי יונים בשכבת הגבול unstirred אמיתי, עשוי לספק תובנה שימושי על עיצוב ניסיוני ועל פרשנות הנתונים הקשורים ויסות נוזלים גזירה של תעלות יונים .
Introduction
זרימת נוזל זה הסימן סביבתי חשוב השולט תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כגון vasodilation הנוצרות על-ידי זרימת נוזל נוזל הטיה תלויי-כוח וסקולרית שיפוץ ופיתוח1,2, 3,4,5. למרות המנגנון המולקולרי אחר התגובות זרימת נוזל הטיה כוח ביולוגי אינם מובנים במלואם, הוא האמין כי תקנה בתיווך זרימת נוזל של יון ערוץ gating עשוי לתרום באופן ביקורתי תגובות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל5 , 6 , 7 , 8. לדוגמה, הפעלת המתקן פנימה אנדותל Kir2.1 ו- Ca2 +-activated K+ (KCa2.3, KCNN3) ערוצי לאחר Ca2 + זרם על ידי זרימת נוזל כבר הציע לתרום נוזל זרימה-induced vasodilation6,7,8. לכן, רבים תעלות יונים, ערוצי במיוחד מופעל מכנית או – עכבות, נחקרו מבחינת זרימת נוזל/הטיה רגישות כוח עם9,10 6,טכניקה תיקון-קלאמפ , 11. עם זאת, בהתאם פרוטוקול נסיוני שבוצעה במהלך תיקון-קלאמפ הקלטה, תוצאות ופרשנות של הנתונים על זרימת נוזלים-תקנות של תעלות יונים יכול להיות מוטעים10,11.
מקור אחד של חפצים הנוצרות על-ידי זרימת נוזל בהקלטה תיקון-קלאמפ היא מצומת פוטנציאלי בין נוזל אמבטיה Ag/AgCl הפניה אלקטרודה11. בדרך כלל הוא האמין כי הצומת נוזלי/מטאל פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl אלקטרודה היא קבועה כמו ריכוז Cl– של נוזל רחצה נשמרת יציבה, שוקל את התגובה הכימית בין הפתרון רחצה Ag/AgCl אלקטרודה להיות:
Ag + Cl–↔ AgCl + אלקטרון (e–) (משוואה 1)
עם זאת, במקרה שבו התגובה הכוללת אלקטרוכימי בין פתרון רחצה אלקטרודה הפניה Ag/AgCl (משוואה 1) ממשיך משמאל לימין, ריכוז Cl– של נוזל רחצה צמוד Ag/AgCl הפניה אלקטרודה (שכבת גבול unstirred12,13,14,15) עשוי להיות נמוך בהרבה מאשר בעיקר רחצה פתרון, אלא אם כן מספיק תחבורה convectional מובטחת. באמצעות אלקטרודה Ag/AgCl ישנים או לא אידאליות הכלרה לקוי של Ag עשוי להגביר סיכון כזה. החפץ הקשורות זרימת נוזל על האלקטרודה הפניה, למעשה, יכול להיות מהכלל על-ידי פשוט הנחת גשר מלח agarose המקובלת בין נוזל רחצה לבין התייחסות אלקטרודה, מאז החפץ מבוסס על שינויים אמיתיים Cl– ריכוז הסמוך ה Ag/AgCl אלקטרודה11. פרוטוקול שהוצגו במחקר זה מתאר כיצד למנוע את השינויים אפשריות הקשורות זרימת צומת ולמדוד את ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred.
לאחר הנחת agarose של אשלגן כלורי גשר בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, יש גורם מכריע נוסף שיש לשקול: Ag/AgCl אלקטרודה רק כהפניה מתנהג כמו אלקטרודה Cl– , תעלות היונים גם יכול לתפקד כמו אלקטרודה יון סלקטיבי. המצב של שכבת הגבול unstirred בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה מתעוררת במהלך תנועת יונים בין הפתרונות חוץ-תאית, תאיים דרך תעלות היונים ממברנה. זה מרמז כי יש להשתמש בזהירות כאשר לפרש ברגולציה של יון ערוצי על ידי זרימת נוזלים. כפי שפורט המחקר הקודם שלנו11, התנועה של יונים דרך פתרון שבו הדרגתי אלקטרוכימי קיים יכול להתרחש באמצעות שלושה ייחודי מנגנונים: דיפוזיה, הגירה, הסעת חום, איפה דיפוזיה התנועה המושרה על ידי ריכוז הדרגתי, ההעברה היא התנועה מונע על ידי מעבר חשמל צבע, הסעת חום הוא התנועה באמצעות זרימת נוזל. בין המנגנונים האלה תעבורה שלוש, הסעת חום מצב תורם לרוב את תנועת יונים11 (> 1,000 פעמים גדול יותר מאשר דיפוזיה או ההעברה תחת הגדרות תיקון הרגיל-קלאמפ). זה מהווה את הבסיס התיאורטי של הסיבה צומת פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה יכול מאוד תחת תנאים שונים סטטי ו זרימת נוזל11.
לפי ההשערה המוצעת לעיל, כמה תופעות facilitatory של זרימת נוזלים בערוץ יון הנוכחי ניתן להסיק מן המחודשת הכנת ריכוז יון האמיתי סמוך לים ערוץ על פני הממברנה (שכבת גבול unstirred) 10. במקרה זה, ההשפעות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל על יון ערוץ זרמי פשוט שהתעוררו מאירועים אלקטרוכימי, לא מן התקנון של gating ערוץ יון. רעיון דומה הוצע בעבר על ידי בארי ועמיתיו12,13,14,15 בהתבסס על השיקולים התיאורטיים קפדני ועל ראיות, הידוע גם בשם השכבה unstirred או אפקט מספר תחבורה. אם כמה תעלות יונים יש מספיק מוליכות ערוץ אחד, מספיק זמן פתיחה-זמן לספק תחבורה מספקת שיעורי דרך הערוצים (מהירה יותר תחבורה תעריף של ממברנה מאשר על גבי המשטח ממברנה unstirred), אפקט בשכבת הגבול שעשויות להתעורר . לפיכך, התעבורה תלויי-הסעת חום יכול לתרום facilitations נוזל-זרימה-induced בסופו של דבר של יון הנוכחי10,12,13,14,15.
במחקר זה, אנו שמים דגש על חשיבות באמצעות אגר או agarose מלח-גשר תוך כדי לימוד נוזל-זרימה-induced רגולציה של זרמי יונים. כמו כן, אנו מספקים שיטה למדידת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred הסמוך Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, הממברנה תעלות היונים. יתר על כן, הפרשנות תיאורטי של אפנון הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים ערוץ יון (קרי, הסעת חום השערה או שכבה unstirred התחבורה מספר אפקט) יכולה לספק תובנות בעלות ערך עבור עיצוב ופרשנות מחקרים על הטיה הכוח-ברגולציה של תעלות יונים. על פי האפקט תעבורה בשכבת הגבול unstirred מספר, אנו צופים כי יון זרמי ערוץ דרך כל סוגי הממברנה תעלות יונים ניתן להקל על ידי זרימת נוזלים, באופן עצמאי את רגישותם ביולוגי לכוח הטיה זרימת נוזלים, אבל רק אם תעלות היונים יש מוליכות ערוץ אחד מספיק פתוח-זמן רב. צפיפויות הנוכחי של ערוץ יון גבוה יותר עשוי להגביר את האפקט unstirred בשכבת הגבול על פני קרום התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, הפגנו שיטה למדידת ריכוז Cl– אמיתי בשכבה unstirred הסמוך האלקטרודה הפניה Ag/AgCl על-ידי קביעת לצומת נוזלי-מטאל פוטנציאלי עם פיפטה תיקון פתוח-קלאמפ מלא של אשלגן גבוהה ריכוז. משמרת של צומת פוטנציאל השינוי בריכוז Cl– בשכבת הגבול יכול לגרום כאשר מחליפים מ סטטי ותנאים של זרימת נוזל….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על-ידי התוכנית מרכז מחקר חלוץ (2011-0027921), על ידי יסוד מדע תוכניות מחקר (2015R1C1A1A02036887 ו- NRF-2016R1A2B4014795) דרך נבחרת מחקר קרן של קוריאה במימון משרד המדע, תקשוב & תכנון העתיד, על ידי מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D פרויקט דרך קוריאה בריאות תעשיית פיתוח המכון (KHIDI), אשר ממומן על ידי משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (HI15C1540).
Materials
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- . A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018)
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
