Medición de la concentración de iones en la capa de límite marchara con pipeta abierta de Patch-Clamp: implicaciones en el Control de los canales iónicos por líquido fluyen
Summary
Canales del ion Mechanosensitive se estudian a menudo en términos de sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo fluido con grabación de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados de flujo de fluido-regulaciones de los canales iónicos pueden ser erróneo. Aquí, ofrecemos métodos para prevenir y corregir estos errores con una base teórica.
Abstract
Flujo de fluidos es un importante estímulo ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos, como la vasodilatación inducida por el flujo de fluido. Aunque no se entienden totalmente los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas para flujo líquido/fuerza, fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente. Por lo tanto, sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo líquido de los canales iónicos ha sido estudiada mediante la técnica de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados y la interpretación de los datos pueden ser erróneas. Aquí, presentamos la evidencia experimental y teórica para errores relacionados con el flujo de líquido y proporciona métodos para estimar, prevenir y corregir estos errores. Cambios en Unión potencial entre el electrodo de referencia Ag/AgCl y el fluido del baño fueron medidos con una pipeta abierta llenada de 3 M KCl. flujo de fluidos podría entonces cambiar el metal líquido cruce potencial de aproximadamente 7 mV. Por el contrario, midiendo el cambio de voltaje inducido por el flujo de fluidos, se estimó la concentración de iones en la capa de límite inviolables. En la condición estática, las concentraciones de iones real junto a la Ag/AgCl referencia electrodo o ion canal entrada en la superficie de la membrana de la célula pueden llegar a tan bajos como 30% de en la condición de flujo. Colocando una agarosa 3 M puente KCl entre el electrodo de referencia y líquido de baño puede haber evitado este problema de desplazamiento potencial de cruce. Sin embargo, el efecto de marchara capa adyacente a la superficie de la membrana de la célula no podría fijarse de este modo. Presentamos un método para medir las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara con una pipeta abierta abrazadera del remiendo, haciendo hincapié en la importancia de utilizar un puente de sal de agarosa mientras estudiaba regulación inducida por el flujo de fluido de las corrientes de ion. Por lo tanto, este nuevo enfoque, que tenga en cuenta las concentraciones reales de iones en la capa de límite inviolables, puede proporcionar la penetración útil en el diseño experimental y la interpretación de los datos relacionados con la regulación de la tensión de esquileo líquido de los canales iónicos .
Introduction
Flujo de fluidos es una importante señal ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos como la vasodilatación inducida por el flujo de líquido y fluido cortante fuerza dependiente vascular remodelación y desarrollo1,2, 3,4,5. Aunque los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas a fuerza de esquileo del flujo de fluidos no se entienden completamente, se cree que fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente a respuestas inducidas por el flujo de fluidos5 , 6 , 7 , 8. por ejemplo, activación del rectificador endotelial interno Kir2.1 y Ca2 +-K activada+ (KCa2.3, KCNN3) canales después de Ca2 + afluencia de flujo de fluidos se ha sugerido para contribuir a líquido vasodilatación inducida por el flujo6,7,8. Por lo tanto, muchos canales del ion, especialmente activado mecánicamente o – inhibición canales, han sido estudiadas en términos de flujo fluido/seguridad sensibilidad a la fuerza con la técnica de patch-clamp6,9,10 , 11. sin embargo, dependiendo del protocolo experimental realizado durante la grabación-abrazadera del remiendo, los resultados y la interpretación de los datos de flujo líquidos-regulaciones de los canales iónicos pueden ser erróneas10,11.
Una fuente de artefactos inducidos por el flujo de fluido en grabación de patch-clamp es de la Unión potencial entre el baño líquido y de electrodo de referencia Ag/AgCl11. Se cree generalmente que la ensambladura del metal líquido potencial entre el baño líquido y el electrodo de Ag/AgCl es constante la concentración de Cl– del líquido del baño se mantenga constante, teniendo en cuenta la respuesta química entre la solución del baño y el electrodo de Ag/AgCl que:
AG + Cl–↔ AgCl + electrón (e–) (ecuación 1)
Sin embargo, en un caso donde la reacción electroquímica general entre la solución de baño y electrodo de referencia Ag/AgCl (ecuación 1) se procede de izquierda a derecha, la concentración de Cl– del baño líquido adyacente a Ag/AgCl de referencia electrodo (capa límite marchara12,13,14,15) puede ser mucho menor que en la mayor parte del baño de solución, a menos que suficiente transporte convencionales está garantizada. Utilizando un electrodo de Ag/AgCl viejo o no ideales con cloración inadecuada de Ag puede aumentar ese riesgo. Este artefacto relacionados con el flujo de fluido en el electrodo de referencia, de hecho, puede ser excluido, simplemente colocando un puente convencional de agarosa-sal entre el baño líquido y referencia electrodo, ya que el artefacto se basa en alteraciones en Cl verdadero– concentración junto a la del electrodo de Ag/AgCl11. El protocolo presentado en este estudio describe cómo prevenir los cambios potenciales relacionadas con el flujo de salida y medir las concentraciones de iones real en la capa de límite inviolables.
Después de colocar una agarosa puente KCl entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl, hay otro factor fundamental que debe considerar: solo como referencia de Ag/AgCl actúa como un electrodo Cl– , los canales iónicos también pueden funcionar como un electrodo selectivo de iones. La situación de una capa límite inviolables entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl se presenta durante el movimiento de iones entre las soluciones a través de los canales iónicos de la membrana extracelulares e intracelulares. Esto implica que debe tener precaución al interpretar la regulación de iones canales de flujo de fluidos. Como comentamos en nuestro anterior estudio11, el movimiento de iones a través de una solución en la que existe un gradiente electroquímico puede ocurrir por tres mecanismos distintos: difusión, migración y convección, donde la difusión es el movimiento inducida por el gradiente de concentración, la migración es el movimiento impulsado por el gradiente eléctrico y la convección es el movimiento a través de flujo de líquido. Entre estos mecanismos de tres transporte, el modo de convección contribuye más al movimiento de iones11 (> 1.000 veces mayor que la difusión o la migración en la configuración habitual de abrazadera del remiendo). Esto forma la base teórica de por qué conexiones posibles entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl pueden muy bajo diferentes condiciones estática y el flujo de fluido11.
Según la hipótesis propuesta anteriormente, algunos efectos facilitatory del flujo de fluidos en el canal de ion actual pueden inferirse de la restauración convectiva de las concentraciones de iones real junto a la entrada del canal en la superficie de la membrana (capa de límite inviolables) 10. en este caso, los efectos inducidos por el flujo fluidos en corrientes del canal de iones simplemente han surgido de eventos electroquímicos, no de la regulación de la compuerta de canal de iones. Una idea similar fue sugerida previamente por Barry y colaboradores12,13,14,15 basado en rigurosas consideraciones teóricas y la evidencia experimental, también conocida como la capa inviolables o efecto del número de transporte. Si algunos canales iónicos tienen suficiente solo canal conductancia y suficientemente largo tiempo abierto para proporcionar suficiente transporte precios a través de los canales (una más rápida tasa de transporte en la membrana que en la superficie de la membrana inviolables), un efecto de capa límite pueden surgir . El transporte dependiente de la convección puede contribuir a las eventual facilitaciones inducida por el flujo de líquido de ion actual10,12,13,14,15.
En este estudio, destacamos la importancia de la utilización de agar o agarosa al puente de sal mientras estudiaba regulación inducida por el flujo de fluido de las corrientes de iones. También proporcionamos un método para medir las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara junto a los Ag/AgCl referencia electrodos y membranas canales de iones. Además, la interpretación teórica de fluido modulación inducida por el flujo de corrientes de canal de iones (es decir, convección hipótesis o efecto número de capa marchara transporte) puede proporcionar información valiosa para diseñar e interpretar estudios sobre cortante fuerza-regulación de canales iónicos. Según el efecto de número de transporte de capa límite inviolables, predecimos que corrientes de canal de iones a través de todos los tipos de canales iónicos de membrana pueden facilitarse por el flujo de líquido, independientemente de su sensibilidad biológica a la fuerza de esquileo del flujo de fluidos, pero sólo si los canales iónicos tienen conductancia suficiente de canal único y tiempo abierto. Mayores densidades de corriente de canal de ion puede aumentar el efecto de la capa límite marchara en la superficie de la membrana de la célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos demostrado un método para medir la real concentración de Cl– en la marchara capa adyacente al electrodo de referencia Ag/AgCl determinando el potencial cruce de metal líquido con una pipeta abierta abrazadera del remiendo con un alta KCl concentración. El cambio en la concentración de Cl– en la capa límite puede resultar en un cambio de potencial de salida cuando se cambia de estática a las condiciones de flujo de fluido. Simplemente usando una agarosa puente KCl en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el programa de centro de investigación pionero (2011-0027921), por programas de básico ciencia investigación (2015R1C1A1A02036887 y NRF-2016R1A2B4014795) a través de la Fundación de investigación nacional de Corea financiado por el Ministerio de ciencia, TIC & Planificación de futuro y por una beca de la Corea salud tecnología R & D Project a través de Corea salud industria desarrollo Institute (KHIDI), financiado por el Ministerio de salud y asistencia social, República de Corea (HI15C1540).
Materials
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
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