Измерение концентрации ионов в Unstirred пограничном слое с открытым патч зажим пипетки: последствия управления ионных каналов жидкости потока
Summary
Mechanosensitive ионные каналы часто изучаются с точки зрения потока жидкости/сдвига силу чувствительности с патч зажим записи. Однако в зависимости от экспериментальный протокол, итоги по жидкости потока правила ионных каналов может быть ошибочным. Здесь мы предлагаем методы для предотвращения и исправления таких ошибок с теоретической основы.
Abstract
Потока жидкости является важной экологической стимул, который контролирует многие физиологические и патологические процессы, такие как жидкости потока индуцированной вазодилатации. Хотя молекулярные механизмы для биологической реакции в жидкости потока/поперечной силы полностью не поняты, жидкости потока опосредованное регулирование ионного канала стробирования может способствовать критически. Таким образом поток жидкости/сдвига силу чувствительности ионных каналов была изучена с помощью метода патча зажим. Однако в зависимости от экспериментальный протокол, результаты и интерпретации данных может быть ошибочным. Здесь мы представляем экспериментальные и теоретические доказательства для жидкости ошибки, связанные с потоком и предоставляют методы для оценки, предупреждения и исправления этих ошибок. Изменения в стыке потенциальных между Ag/AgCl электрод сравнения и жидкость для купания были измерены с открытым пипетки, заполнены с 3 M KCl. потока жидкости может затем сдвиг потенциал приблизительно 7 mV жидкости/металлические соединения. И наоборот измеряя напряжение сдвига, индуцированный поток жидкости, мы оценили концентрации ионов в unstirred пограничном слое. В статических условиях реальная ионная концентрации, прилегающих к Ag/AgCl ссылка электрода или ионного канала входе на поверхности клеточной мембраны может достигать как низко как примерно 30% в состояние потока. Размещение агарозы 3 M KCl мост между электродом жидкости и ссылка купание может предотвратить эту проблему потенциального перехода перекрестка. Однако эффект unstirred слоя, прилегающих к поверхности клеточной мембраны не может быть исправлена таким образом. Здесь мы предоставляем метод для измерения концентрации реальных ионов в unstirred пограничном слое с открытым патч зажим пипетку, подчеркивая важность использования агарозы соли мост во время учебы жидкости регулирования потока индуцированной ионных токов. Таким образом этот новый подход, который учитывает реальные концентрации ионов в unstirred пограничном слое, может оказаться полезным на экспериментальный дизайн и интерпретации данных, относящиеся к жидкости касательное напряжение регулирования ионных каналов .
Introduction
Потока жидкости — важные экологические подсказка, которая контролирует многие физиологические и патологические процессы, такие как жидкости потока индуцированной вазодилатацию и жидкости сдвига силы зависимых сосудистой реконструкции и развития1,2, 3,4,5. Хотя молекулярные механизмы биологической реакции на поперечной силы потока жидкости полностью не поняты, считается, что жидкости потока опосредованное регулирование ионного канала стробирования критически может способствовать жидкости потока индуцированной ответы5 , 6 , 7 , 8. Например, активации эндотелиальной внутрь выпрямителя Kir2.1 и Ca2 +-активированные K+ (KCa2.3, KCNN3) каналы после Ca2 + приток жидкости потока было предложено вносить жидкости поток индуцированной вазодилатация6,,78. Таким образом, многие каналы иона, особенно механически активированного или – тормозится каналов, были изучены с точки зрения потока жидкости/сдвига силу чувствительности с патч зажим техника6,9,10 , 11. Однако, в зависимости от экспериментальный протокол, выполненных во время фиксации записи, результаты и интерпретации данных о жидкости потока правила ионных каналов может быть ошибочным10,11.
Один источник жидкости потока индуцированной артефактов в патч зажим записи — от перекрестка потенциальных между теплоносителя и ссылка Ag/AgCl электродов11. Считается, что жидкость/металл стыке потенциальных между купания жидкости и Ag/AgCl электродов постоянно как концентрация Cl– купания жидкости остается неизменной, учитывая химической реакции между купания решения и Ag/AgCl электродов для:
AG + Cl–↔ AgCl + Электрон (e–) (уравнение 1)
Однако в случае, где в целом электрохимической реакции между купания решения и ссылка Ag/AgCl электродов (уравнение 1) выполняется слева направо, концентрация Cl– купания жидкости рядом с Ag/AgCl ссылки электрод (unstirred пограничный слой12,13,14,15) могут быть намного ниже, чем в основную часть купания решения, если достаточно конвекционный транспорт обеспечивается. Использование старых или неидеальной Ag/AgCl электродов с неадекватным хлорирования Ag может увеличить такой риск. Этот жидкости связанных с потоком артефакт на электрод сравнения, в самом деле, могут быть исключены, просто поместив обычных агарозы солевой мост между купания жидкости и ссылка электрода, так как артефакт основан на изменения в реальном Cl– концентрация рядом с Ag/AgCl электродов11. Протокол, представленный в настоящем исследовании описывает, как для предотвращения потенциальных изменений связанных с потоком соединения и измерять концентрации реальных ионов в unstirred пограничном слое.
После размещения агарозы KCl мост между купания жидкости и Ag/AgCl электрод сравнения, является другим важным фактором, который следует рассматривать: просто как ссылка Ag/AgCl электродов действует как электрод Cl– , ионные каналы также может функционировать как ионоселективного электрода. Ситуация unstirred пограничный слой между купания жидкости и Ag/AgCl электродов ссылка возникает во время движения ионов между внеклеточным и внутриклеточных решения через мембранных ионных каналов. Это означает, что необходимо с осторожностью подходить при интерпретации регулирование ионных каналов потока жидкости. Как указывалось в наших предыдущих исследования11, движение ионов через решения, в котором присутствует электрохимических градиент может происходить через три отдельных механизмов: диффузия, миграция и конвекции, где Диффузия это движение индуцированных градиент концентрации, миграция движение, движимый электрического градиента, и конвекции движения потока жидкости. Среди этих трех транспортных механизмов режим конвекции вносит наиболее движение ионов11 (> 1000 раз больше, чем диффузии или миграции под обычной фиксации параметров). Это формирует теоретические основы, почему Джанкшен потенциальных между купания жидкости и Ag/AgCl электродов ссылка может очень под различные статические и жидкости потока условия11.
Согласно гипотезе, предложенных выше, некоторые протекать эффекты потока жидкости на текущий ионного канала может быть выведено из конвективных восстановление реальных ионной концентрации рядом с входной канал на поверхности мембраны (unstirred пограничный слой) 10. В этом случае жидкости потока индуцированные эффекты у ионных токов канал просто возникли из электрохимических события, не от регулирования ионного канала стробирования. Аналогичная идея было ранее предложено Барри коллег12,13,14,и15 на основании строгих теоретических соображений и экспериментальных доказательств, также известный как unstirred слой или номер эффект транспорта. Если некоторые каналы иона имеют достаточно одного канала проводимости и достаточно долго открытым время предоставить достаточные транспортные ставки через каналы (транспорта быстрее в мембранных чем в поверхности unstirred мембраны), пограничный слой эффект может возникнуть . Таким образом конвекции зависимых транспорта может способствовать окончательной жидкости поток индуцированной льгот Ион текущих10,12,13,14,15.
В этом исследовании, мы подчеркиваем важность использования агар или агарозы соли мост во время учебы жидкости поток индуцированной регулирование ионных токов. Мы также предоставляют метод для измерения концентрации реальных ионов в unstirred пограничный слой, прилегающий к Ag/AgCl ссылка электрода и мембранных ионных каналов. Кроме того теоретические интерпретации жидкости модуляции потока индуцированной ионного канала токов (то есть конвекция гипотеза или unstirred слой транспорта номер эффект) могут предоставить ценную информацию для разработки и интерпретации исследований на сдвига силы регулирование ионных каналов. Согласно unstirred пограничного слоя транспорта номер эффект мы прогнозируем, что ионного канала токов через все виды мембранных ионных каналов может быть облегчено потока жидкости, независимо от их биологической чувствительности к поперечной силы потока жидкости, но только, если ионные каналы имеют достаточно одного канала проводимости и долго открытым. Высших плотностях тока ионного канала может увеличить эффект unstirred пограничного слоя на поверхности клеточной мембраны.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы продемонстрировали метод измерения реальной концентрации Cl– в unstirred слой, прилегающий к Ag/AgCl электродов ссылку путем определения перекрестка жидкости металл потенциал с открытым патч зажим пипетки, заполнены с высокой KCl концентрация. Изменение концентра?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано пионер исследовательский центр программы (2011-0027921), основными программами исследований науки (2015R1C1A1A02036887 и СР 2016R1A2B4014795) через Национальный исследовательский фонд Кореи финансируется министерством науки, ИКТ & Будущее планирование и Грант Кореи медицинских технологий R и D проекта через Корея здравоохранения Институт развития индустрии (ХИДИ), финансируемая министерством здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (HI15C1540).
Materials
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- . A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018)
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
