السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس
Summary
نقدم هنا بروتوكولا للكالسيوم في صورة إشارات في سكان أنواع الخلايا الفردية في الوصلات العصبية العضلية مورين.
Abstract
يمكن رصد النشاط الكهربائي للخلايا في الأنسجة بالتقنيات الكهربية، ولكن هذه عادة ما يقتصر على تحليل الخلايا الفردية. نظراً لزيادة الكالسيوم داخل الخلايا (Ca2 +) في سيتوسول غالباً ما تحدث بسبب النشاط الكهربائي، أو استجابة لعدد ضخم محفزات الأخرى، يمكن رصد هذه العملية بتصوير الخلايا محملة الفلورسنت المراعية للكالسيوم الأصباغ. ومع ذلك، من الصعب صورة هذه الاستجابة في نوع خلايا فردية داخل الأنسجة كاملة لأن يتم تناول هذه الأصباغ بجميع أنواع الخلايا داخل الأنسجة. على النقيض من ذلك، مؤشرات الكالسيوم المشفرة جينياً (جيسيس) يمكن التعبير عنها حسب نوع خلية فردية وفلوريس في استجابة لزيادة من داخل الخلية Ca2 +، مما سمح التصوير من Ca2 + إشارات في مجموعات سكانية بأكملها من أنواع الخلايا الفردية. هنا، علينا تطبيق الاستخدام من جيسيس GCaMP3/6 على الوصلات العصبية العضلية الماوس، وخلايا شوان المشبك ثلاثية بين الخلايا العصبية الحركية، والهيكل العظمى والعضلات، والمحطة الطرفية/بيريسينابتيك. علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب في الكلاسيكية السابقين فيفو الاستعدادات الأنسجة. استخدام تقسيم بصري، نقوم بالتصوير المزدوج-الطول الموجي لدينامية Ca2 + إشارات وتسمية ثابتة من الوصلات العصبية العضلية (NMJ) في نهج التي يمكن تكييفها بسهولة لرصد اثنين جيتشي الخلية المحددة أو الجهد وراثيا المرمزة المؤشرات (جيفي) في نفس الوقت. وأخيراً، نحن نناقش الإجراءات المستخدمة لالتقاط خرائط مكانية لشدة الأسفار. معا، يمكن أن تستخدم هذه التقنيات البصرية والمعدلة وراثيا والتحليلية لدراسة النشاط البيولوجي للفئات السكانية الفرعية خلية متميزة في NMJ في مجموعة متنوعة من السياقات.
Introduction
NMJ، مثل جميع نقاط الاشتباك العصبي، ويتألف من ثلاثة عناصر هي: محطة presynaptic المستمدة من خلية، خلية بوستسينابتيك العصبية/المستجيب، وخلية بيريسينابتيك الدبقية1،2. في حين أظهرت الجوانب الأساسية لانتقال متشابك أولاً في هذا المشبك3، العديد من جوانب هذه العملية تظل مجهولة، جزئيا بسبب التعبير عن جزيئات نفس عناصر خلوية متميزة من هذا المشبك. على سبيل المثال، يتم التعبير عن مستقبلات لكل من البيورين نوكليوتيد الأدنين ATP واستيل (ACh)، الذي شارك تم إصدارها من قبل الخلايا العصبية الحركية في NMJ الفقارية، بالعضلات وخلايا شوان والخلايا العصبية الحركية، مما يعقد تفسير أي تأثير الوظيفية التي تمارس بها هذه المواد (مثلاً، الإفراج عن الإرسال أو الرد، توليد قوة العضلات)4. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن مكونات الثلاثية NMJ بسيطة مقارنة إلى، على سبيل المثال، الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الذي غالباً ما يحمل مدخلات متعددة متشابك، عما إذا كانت الخلايا العصبية الحركية، والخلايا العضلية أو خلايا شوان تختلف في الاستجابة للمحفزات على أساس على ما مضمن عدم التجانس (مثلاً، اشتقاق الجنينية، النوع الفرعي للألياف، ومورفولوجيا) غير واضح. بغية معالجة كل مسألة من هذه المسائل، أنه سيكون من المفيد لتعقب الاستجابة للعديد من الخلايا داخل أحد العناصر متشابك، فضلا عن المسار، في الوقت نفسه، هذه استجابة في أي من عناصر منفصلة أخرى في نفس الوقت. الاستراتيجيات التقليدية باستخدام الأصباغ الكيميائية لقياس إشارات الكالسيوم لا يمكن تحقيق هذين الهدفين، لأنه هو تناول تطبيق حمام صبغة بأنواع متعددة من الخلايا بعد التطبيق للأنسجة، ويمكن استخدام صبغة إينتراسيلولارلي تحميل فقط تصور الأفواج الفردية أو الصغيرة من الخلايا. هنا، استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن جيسيس مصممة لقياس إشارات الكالسيوم خلية على حدة، جنبا إلى جنب مع تصوير محددة و أدوات البرمجيات5، يمكننا إثبات الأول من هذين الهدفين عموما، ومناقشة كيفية الإضافة جديد أدوات معدلة وراثيا سوف يساعد على تحقيق الثاني. سوف تكون هذه التقنية مفيدة لأي شخص مهتم في تتبع ديناميات الكالسيوم أو الخلوية الأخرى مما يشير إلى أحداث يمكن ملاحظتها من خلال أجهزة الاستشعار البصرية ترميز الجينات في السكان خلية متعددة في نفس الوقت.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم بعض الأمثلة لقياس Ca2 + الردود في خلايا معينة في الأنسجة العضلية سليمة معربا عن جيتشي الفئران باستخدام. بغية تنفيذ هذه التجارب بنجاح، من الضروري لا تصيب العصب فرينيك أثناء التشريح. الصورة Ca2 + الردود في خلايا شوان في السلطة أما منخفضة أو عالية (أي20 X أو 60 X)، من الضروري …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) GM103554 و GM110767 إلى (T.W.G.) والمركز الوطني “بحوث الموارد” 5P20RR018751 و GM103513 8 ف 20 المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (إلى G.W.H.).
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
- Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
- Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
- Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).
- Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).
- Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
- Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
- Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839 (2018).
- Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
