Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング
Summary
マウスの神経筋接合部で個々 のセル型の集団のイメージ カルシウムにプロトコルをご紹介します。
Abstract
電気生理学的手法による組織内の細胞の電気的活動を監視できますが、これらは通常個々 の細胞の分析に限られています。細胞のイメージングを搭載蛍光カルシウムに敏感な細胞内カルシウム (Ca2 +) 細胞質の増加は多くの場合電気的活動のため発生しますまたは、無数の他の刺激に応答して、このプロセスを監視できますので染料。 しかし、これらの染料は、組織内のすべてのセル型からとられるので全体の組織内の個々 のセル型のこの反応をイメージすることは困難です。対照的に、遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) 個々 のセル型で表現できるので、細胞内 Ca2 +Ca2 +の全人口におけるシグナル伝達のイメージングが可能の増加への応答で蛍光を発する個々 のセルの種類。ここでは、マウス神経筋接合部に使用 GECIs GCaMP3/6 の適用、シュワン細胞の運動神経細胞、骨格筋、「ターミナル/間の三者のシナプス。古典的な前のヴィヴォティッシュの準備でこの手法の有用性を示す.光スプリッターを使用すると、我々 実行動的 Ca2 +シグナルのデュアル波長イメージングと神経筋接合部 (NMJ) の静的なラベル 2 つのセルに固有の GECI または遺伝的コード化の電圧監視に容易に適応させることができる方法で指標 (GEVI) 同時に。最後に、蛍光強度の空間マップをキャプチャするために使用されるルーチンをについて説明します。一緒に、さまざまなコンテキストで NMJ で明瞭な細胞の亜集団の生物活性を検討するこれらの光、トランスジェニック、分析技術を使用できます。
Introduction
NMJ は、すべてのシナプスのような 3 つの要素で構成されます: シナプス前終末に由来するニューロンは、シナプス後ニューロン/エフェクター細胞とグリア perisynaptic セル1,2。シナプス伝達の基本的な側面は、このシナプス3で披露された最初中、このプロセスの多くの側面のこのシナプスの異なる細胞要素によって同じ分子の発現のために部分、不明なまま。いずれかの解釈をこのように複雑運動ニューロン、シュワン細胞、筋肉、脊椎動物の略記で運動ニューロンによって解放共同、プリン アデニン ヌクレオチド ATP とアセチルコリン (ACh) の両方の受容体を表現するなどこれらの物質 (例えば伝達物質放出または応答の、筋力生成) の4によって加えられる機能に影響します。さらに、略記の三者のコンポーネントは単純な比較に、たとえば、複数のシナプス入力をよく表わす中枢神経系ニューロン運動神経細胞、筋細胞や Schwann 細胞による刺激に応じて変化するかどうか本質的な不均一性 (例えば、萌芽期の誘導、繊維のサブタイプ、形態) は明確ではないです。これらの各問題を対処するために有利なトラック、同時に、その他の個別の要素のいずれかでこのような反応と同様、1 つのシナプス要素内の多くの細胞の応答を同時に追跡することです。バス適用色素は組織に適用された後複数の細胞のタイプによってとらし、細胞内で読み込まれている色素は、視覚化するのみ使用できますのでカルシウム シグナルを測定する化学染料を使用して従来の戦略はこれら 2 つの目標を達成できません。セルの個人や小集団。ここでは、セル固有カルシウム シグナル、特定のイメージングとソフトウェア ツール5、これらの 2 つの全体的な目標の最初から、議論を測定するように設計 GECIs を発現するトランスジェニック マウスを用いた方法のまた新しいトランスジェニック ツールは、2 番目の達成を助けるでしょう。この手法はカルシウム動態や同時に複数のセル人口の遺伝子符号化光センサーを通してイベント観測可能なオブジェクトをシグナルその他の携帯電話の追跡に興味がある人の役に立つでしょう。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、Ca2 +応答 GECI 発現マウスを用いたそのままの筋組織の特定のセルを測定するいくつかの例を提供します。これらの実験を正常に実行するために横隔神経を傷つけないように解剖中が不可欠です。低または高電力 (すなわち20 X、60 X) でシュワン細胞の Ca2 +応答をイメージするには、BHC またはブロックの動きに μ-コノトキシンのいずれかを使用する必要です。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事は、資金の健康 (NIH) の GM103554 と GM110767 (T.W.G.) に国立衛生研究所国立研究資源 5P20RR018751 センターから国立総合医学研究所 8 P 20 GM103513 (G.W.H.) にも対応しました。
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
References
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