Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.
Abstract
Die elektrische Aktivität der Zellen in den Geweben durch elektrophysiologische Techniken überwacht werden kann, aber diese sind in der Regel auf die Analyse der einzelnen Zellen beschränkt. Da eine Erhöhung der intrazellulären Kalzium (Ca2 +) in die Zellflüssigkeit oft aufgrund der elektrischen Aktivität tritt oder in Reaktion auf eine Vielzahl von anderen reizen, dieser Prozess sich durch lässt die Darstellung der Zellen mit fluoreszierenden Calcium-Sensitive geladen Farbstoffe. Allerdings ist es schwierig, diese Antwort in einer einzelnen Zelle Art im gesamten Gewebe Bild, da diese Farbstoffe durch alle Zelltypen im Gewebe entnommen werden. Im Gegensatz dazu genetisch codierte Kalzium Indikatoren (GECIs) können durch eine einzelne Zelle Art ausgedrückt werden und fluoreszieren in Reaktion auf eine Erhöhung der intrazellulären Ca2 +, erlaubt die Bildgebung von Ca2 + in der gesamten Bevölkerung der Signalisierung einzelnen Zelltypen. Hier wenden wir die Verwendung von GECIs GCaMP3/6 auf der Maus neuromuskulären Synapse, eine dreigliedrige Synapse zwischen Motoneuronen, Skelettmuskel und Terminal/Perisynaptic Schwann-Zellen. Wir zeigen den Nutzen dieser Technik im klassischen ex Vivo Gewebe Vorbereitungen. Mit Hilfe eines optischen Splitters, führen wir Dual-Wellenlänge Bildgebung der dynamischen Ca2 + Signale und eine statische Beschriftung der neuromuskulären Synapse (NMJ) in einem Ansatz, der an zwei zellspezifische GECI oder genetisch codierte Spannung überwachen leicht angepasst werden könnte Indikatoren (GEVI) gleichzeitig. Schließlich diskutieren wir die Routinen verwendet, um räumliche Karten der Fluoreszenzintensität zu erfassen. Zusammen, können diese optischen, transgenen und analytische Techniken eingesetzt werden, um die biologische Aktivität der Zelle unterschiedliche Subpopulationen bei NMJ in einer Vielzahl von Kontexten zu studieren.
Introduction
NMJ, wie alle Synapsen besteht aus drei Elementen: ein präsynaptischen Terminal abgeleitet eines Neurons, einer postsynaptischen Neuron/Effektor-Zelle und eine Perisynaptic glial cell1,2. Während die grundlegenden Aspekte der synaptischen Übertragung dieser Synapse3erstmals nachgewiesen wurden, bleiben viele Aspekte dieses Prozesses unbekannt, teilweise aufgrund der Ausdruck der gleichen Moleküle durch die ausgeprägte zelluläre Elemente dieser Synapse. Beispielsweise werden Rezeptoren für die Purin Adenin Nukleotide ATP und Acetylcholin (ACh), die von Motoneuronen bei Wirbeltieren NMJ Co freigesetzt werden, durch Muskel-, Schwann-Zellen und motorischen Neuronen, so erschwert die Interpretation eines ausgedrückt. funktionelle Wirkung ausgeübt durch diese Substanzen (z.B.Sender Freigabe oder Antwort, Muskel Krafterzeugung)4. Darüber hinaus die dreigliedrigen Komponenten der NMJ sind zwar einfach im Vergleich zu, z. B. Neuronen im zentralen Nervensystem die oft mehreren synaptischen Eingänge aufweisen ob die motorischen Nervenzellen, Muskelzellen oder Schwann-Zellen als Reaktion auf Reize, die Basis variieren auf ihre inneren Heterogenität (z.B., embryonale Ableitung, Faser-Subtyp, Morphologie) ist unklar. Um alle diese Probleme zu lösen, wäre es vorteilhaft, die Reaktion vieler Zellen innerhalb einer synaptischen Element sowie Track, zur gleichen Zeit, solch eine Reaktion auf die einzelnen Elemente gleichzeitig verfolgen. Konventionelle Strategien mit chemischen Farbstoffen zu Kalzium Signalisierung messen können diese zwei Ziele nicht erreichen, weil Bad angewendet Farbstoff durch mehrere Zelltypen nach Anwendung auf Gewebe aufgenommen wird und intrazellulär geladen Farbstoff nur verwendet werden, kann um zu visualisieren Person oder einer kleinen Kohorten von Zellen. Hier, mit Hilfe transgener Mäuse mit dem Ausdruck GECIs entworfen, um zellspezifische Kalzium Signalisierung zusammen mit bestimmten Bildgebung und Software Tools5, wir führen die erste dieser zwei allgemeine Ziele und erläutern wie die Zugabe von neu Transgene Werkzeuge würde helfen, die Sekunde zu erreichen. Diese Technik wird für alle interessierten bei der Verfolgung von Kalzium Dynamik oder andere zellulare signalisieren Ereignisse beobachten durch gen-kodierte optische Sensoren in mehrere Zellpopulationen zur gleichen Zeit nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir einige Beispiele für Ca2 + Antworten in bestimmte Zellen in intaktem neuromuskuläre Gewebe mit Hilfe von GECI exprimierenden Mäusen zu messen. Um diese Experimente erfolgreich durchführen zu können, ist es nicht unbedingt Nervus phrenicus während der Präparation zu verletzen. Um Ca2 + Antworten in Schwann-Zellen bei hohen oder niedrigen Leistung (d.h.20 X oder X 60) Bild, ist es notwendig, BHC oder µ-vor Block Bewegung zu verwenden. Für Niederleistungs-Bildgebung v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus den National Institutes of Health (NIH) GM103554 und GM110767, (T.W.G.) und das National Center for Research Resources 5P20RR018751 und das National Institute of General Medical Sciences 8 P 20 GM103513 (zu G.W.H.) unterstützt.
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
- Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
- Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
- Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).
- Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).
- Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
- Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
- Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839 (2018).
- Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
