Summary

Hyperandrogenic мыши модель для изучения синдром поликистозных яичников

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

Мы описываем разработке худой модели мыши СПКЯ как с дигидротестостерон гранулы для изучения патофизиологии СПКЯ и потомство от этих плотин СПКЯ как.

Abstract

Hyperandrogenemia играет решающую роль в репродуктивной и метаболические функции женщин и является отличительной чертой polycystic синдром завязи. Разработка худой СПКЯ как мыши модели, которая имитирует женщин с СПКЯ клинически значимым. В этом протоколе мы описываем такой модели. Вставив длиной 4 мм гранулы порошка DHT (дигидротестостерон) кристалл (Общая длина гранул составляет 8 мм), и заменив его ежемесячно, мы в состоянии производить СПКЯ как модель мыши с сыворотка DHT уровней 2 раза выше, чем мышей, не имплантируются с DHT (без Дигидротестостерон). Мы наблюдали репродуктивного и метаболической дисфункцией без изменения веса тела и состава тела. В то время как выставке высокую степень бесплодия, небольшое подмножество этих самок мышей СПКЯ как можно получить супоросыми и их потомство Показать задержка полового созревания и увеличение тестостерона как взрослые. Эта модель СПКЯ как худой мыши является полезным инструментом для изучения патофизиологии СПКЯ и потомство от этих плотин СПКЯ как.

Introduction

Гиперандрогении является отличительной чертой синдром поликистозных яичников (СПКЯ) критериев NIH и избыток андрогенов и СПКЯ (AE-СПКЯ) общества. Женщин с СПКЯ иметь затруднение получить супоросы и имеют повышенный риск осложнений беременности1. Даже если они забеременеть, потомства женщины имеют неблагоприятные последствия для здоровья по результатам2,3. Животные модели были разработаны с использованием различных стратегий4,5,6,,78,9,10,11 , 12 и экспонирования множество функций с увеличение веса и ожирения, связанные с повышенной Адипоцит вес и размер расширенного Адипоцит СПКЯ (ановуляция, и или ослабленным терпимости глюкозы и инсулина). Существуют две основные стратегии производить Животные модели, которые используются для изучения СПКЯ. Один является лечение с высоким уровнем андрогенов напрямую (экзогенных андрогенов инъекций/вставки) или косвенно (например, блокируя андрогенных конверсия в эстроген с ингибитором ароматазы) после рождения13. Еще одним примером плода hyperexposure андрогенов во время беременности14,15 для изучения потомства. Например женщина потомство от резус16,17, овец18и грызуны, подвержены мужчины уровни андрогенов в период внутриутробного развивать черты СПКЯ как позже в жизни. Эти модели значительно усилить наше понимание повышенных андрогенных эффектов и плода программирование и матки экологические последствия. Однако, эти модели имеют свои собственные ограничения: 1) животных развития ожирения и поэтому трудно отделить последствия hyperandrogenemia от ожирения индуцированной репродуктивного и метаболической дисфункцией; 2) до беременности женщин с СПКЯ уже демонстрируют высокий уровень андрогенов, таким образом ооциты были подвержены андрогенов избыток до оплодотворения; 3) фармакологических дозы тестостерона (T) или дигидротестостерон (ДГТ) используется после рождения или во время беременности может не отражать андрогенов среды СПКЯ. Тестостерон и DHT уровни были измерены в яичников фолликулярной жидкости и/или сыворотки, и тестостерон и уровни DHT 1,5-3,9 раза выше у женщин с СПКЯ5,19,20,21 ,,2223 по сравнению с затрагивает женщин. Мы создали взрослой мыши модель23,24,25 , разрабатывающая репродуктивного и метаболической дисфункцией в течение двух недель начало хронического воздействия DHT от вставки лепешки с длиной 4 мм кристаллический порошок DHT (Общая длина гранул составляет 8 мм). Эта модель производит DHT сыворотке, которые примерно вдвое выше (именуемая 2xDHT) чем у управления мышей без DHT лечения. 2xDHT мышей не демонстрируют изменения базальной сыворотки эстрадиола, тестостерон, LH и делать не развивать ожирения и показывают аналогичные яичников масса, сывороточные уровни холестерина, свободных жирных кислот, лептин, TNFα и IL-623,24, 25 относительно контролирует даже до 3,5 месяцев после DHT вставки23,24,25. Кроме того путем спаривания самок, которые уже разработали функции СПКЯ, мы можем изучить влияние hyperandrogenic материнской среды на метаболические и репродуктивного здоровья потомства15.

Эта новая парадигма (отношение к НИЗ и AE-СПКЯ общества критерии) моделях производства относительно сходные уровни андрогенов для женщин с СПКЯ 2 – 3 раза выше тестостерона или уровни DHT, по сравнению с неизменным женщин болезнь. Однако эта модель поддерживается постоянное экзогенных DHT и не от запрограммированных эндогенного гиперандрогении после вывода DHT. Общая цель этой статьи заключается в том, сосредоточиться на 1) как сделать DHT гранулы; 2) как создать худой СПКЯ как модель мыши; 3) стратегии по оценке потомства от этих плотин. Другие измерения и оценки фенотипы не рассматриваются в этой рукописи, но можно найти в5,15,23,24,25,26.

Protocol

Здесь мы представляем подробные протоколы для подготовки Пелле DHT и вставки и репродуктивного и метаболических тестирования. Мышей, используемые в данном исследовании были смешанного происхождения (C57/B6, CD1, 129Sv) и поддерживались с пищей и водой ad libitum в цикле свет/темно 14/10 h при 24 ° C ?…

Representative Results

Сывороточные уровни DHT и тест на переносимость глюкозы Уровни DHT были измерены от собранных сыворотки обоих ELISA и LC-MS согласно протоколу 1,24 – 1,25 и 2,9, 3.0. DHT абсолютные значения отличаются между масс-спектрометрии и ELISA, однако относительная…

Discussion

Гиперандрогении является ключевой особенностью СПКЯ. Уровни DHT сыворотки (два раза выше в DHT мышей чем без Дигидротестостерон мышей), используемые в настоящем Протоколе ниже, чем те, которые сообщили другие следователи в предыдущих исследованиях и калибруются пропорционально имитиров?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (гранты R00-HD068130 по с.в.) и исследовательский центр в Балтимор диабет: пилотов и осуществимость Грант (чтобы с.в.).

Materials

Crystalline 5α-DHT powder   Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085in/2.15mm outer diameter
Medical adhesive silicone  Factor II, InC.  A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
 10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
  Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring  Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
 attached needle: 20G BD 305176
 Ruler: any length than 10cm with milimeter scale. 
Xylazine  Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100mg/ml
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100mg/ml
 Surgical staple  AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
 Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
 Trochar  Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Supplier Diversity Partner
Manufacturer:  Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life
Animal tattoo ink paste Ketchum manufacturing Inc. Brockville, Ontario, Canada
Scale Ohaus Corporation  HH120D Pine Brook, NJ
Electronic digital caliper NEIKO Tools USA 01407A available from Amazon

References

  1. Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
  2. Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
  3. de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , (2018).
  4. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
  5. van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
  6. Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
  7. Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
  8. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  9. Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
  10. Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
  11. Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
  12. Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
  13. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  14. Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS?. Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
  15. Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
  16. Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome?. Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
  17. Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome – a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
  18. Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
  19. Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
  20. Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
  21. Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
  22. Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
  23. Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
  24. Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
  25. Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
  26. van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function?. Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
  27. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , (2009).
  28. Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
  29. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  30. Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  31. Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
  32. McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
  33. Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
  34. Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).

Play Video

Cite This Article
Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

View Video