Visualisation en temps réel et l’analyse des chondrocytes blessures résultant d’un chargement mécanique des explants de Cartilage Murine Intact
Summary
Nous présentons une méthode pour évaluer l’étendue spatiale de blessure/mort cellulaire sur la surface articulaire des articulations murines intactes après l’application de contraintes mécaniques contrôlées ou les impacts. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer comment l’arthrose, les facteurs génétiques et/ou chargement différents schémas thérapeutiques affectent la vulnérabilité des chondrocytes de in situ .
Abstract
Homéostasie du cartilage articulaire dépend de la viabilité des cellules résidentes (chondrocytes). Malheureusement, traumatisme mécanique peut induire la mort de chondrocytes généralisée, pouvant déboucher sur une dégradation irréversible de l’articulation et l’apparition de l’arthrose. En outre, maintien de la viabilité de chondrocyte est important dans les procédures de greffe ostéo pour des résultats optimaux de chirurgie. Nous présentons une méthode pour évaluer l’étendue spatiale de blessure/mort cellulaire sur la surface articulaire des articulations synoviales murines intactes après l’application de contraintes mécaniques contrôlées ou les impacts. Cette méthode peut être utilisée dans des études comparatives pour étudier les effets d’une charge mécanique différents schémas thérapeutiques, différentes conditions environnementales ou des manipulations génétiques, ainsi que les différentes étapes de la dégénérescence du cartilage à court et/ou à long terme vulnérabilité des chondrocytes articulaires in situs. L’objectif du protocole introduit dans le manuscrit est d’évaluer l’étendue spatiale de blessure/mort cellulaire sur la surface articulaire des articulations synoviales murines. Ce qui est important, cette méthode permet l’essai sur le cartilage intact sans compromettre les conditions aux limites natives. En outre, il permet une visualisation en temps réel des chondrocytes articulaires vitale tachées et seule analyse axée sur l’image de lésion cellulaire induite par l’application de statique contrôlé et chargement des schémas d’impact. Nos résultats représentatifs démontrent que des explants de cartilage sain, l’étendue spatiale des lésions des cellules dépend sensiblement intensité ampleur et l’impact de charge. Notre méthode peut être facilement adapté pour étudier les effets d’une charge mécanique différents schémas thérapeutiques, différentes conditions environnementales ou des manipulations génétiques différentes sur la vulnérabilité de la mécanique des in situ des chondrocytes articulaires.
Introduction
Le cartilage articulaire (AC) est une tissu qui recouvre et protège les os dans des articulations synoviales, fournissant une articulation commune lisse de charge. L’homéostasie tissulaire est tributaire de la viabilité des chondrocytes, le type de cellule unique demeurant à AC. Cependant, exposition du cartilage aux forces extrêmes due à un traumatisme (p. ex., chutes, blessures attribuables aux accidents ou sports véhicules) ou en raison de l’instabilité post-traumatique conjointe peut induire des chondrocytes mort, conduisant à une dégradation irréversible de l’articulation (arthrose) 1. en outre, en autogreffe greffe des procédures qui visent à réparer les défauts les de cartilage endommagé, greffe associée à insertion mécanique un traumatisme réduit la viabilité des chondrocytes et a des effets préjudiciables sur les résultats chirurgicaux2.
Cartilage explant modèles sont couramment utilisés pour étudier la susceptibilité des chondrocytes articulaires à la mort cellulaire induite par mécaniquement. Ces modèles utilisent généralement des explants de grands animaux pour étudier les effets du chargement des conditions, des conditions environnementales et autres facteurs sur cellule vulnérabilité3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Toutefois, en raison de la grande taille des articulations indigènes, ces modèles exigent généralement la suppression d’une fiche de la surface articulaire d’une articulation intacte, ainsi compromettre native des conditions aux limites. En outre, ils exigent généralement demande d’importantes charges mécaniques pour induire des lésions des cellules. Alternativement, cartilage murine explant modèles offrent plusieurs avantages par rapport à des modèles animaux plus gros dans l’étude de la vulnérabilité mécanique des chondrocytes de in situ . En particulier, en raison de leurs dimensions réduites, ces modèles facilitent les tests du cartilage articulaire intact sans altérer l’intégrité des tissus natifs. En outre, chargement du cartilage murin se produit sur de petites surfaces de contact tels que chondrocyte mort ou blessure peut être induite avec petites charges (< 1 N). Enfin, le génome de la souris est facilement manipulé, permettant aux essais d’impact de gènes spécifiques comment la susceptibilité des in situ les chondrocytes à une lésion mécanique.
L’objectif global de la méthode introduite dans ce manuscrit est de quantifier et de visualiser-dans-temps réel-l’étendue spatiale de in situ cellule décès et de blessures en raison des charges mécaniques appliquées sur souris entièrement intacte du cartilage-sur-OS des explants in vitro. Cette méthode nécessite une dissection minutieuse des articulations synoviales souris sans compromettre la viabilité des chondrocytes, suivie d’essais mécaniques des explants vitale colorées en utilisant un dispositif monté sur microscope semblable à une plate-forme de test que nous avons récemment développé pour quantifier le cartilage murine propriétés mécaniques16. Au cours des essais mécaniques, une grande partie de la surface articulaire (intacte) de l’OS disséqué est visible sur une micrographie de fluorescence unique, permettant une analyse rapide de la viabilité cellulaire après qu’une charge est appliquée. Une analyse similaire de la viabilité des cellules de surface des explants de cartilage murine a effectué précédemment, mais sans application simultanée d’une charge de17. Les applications potentielles de notre méthode comprennent des études comparatives pour étudier la vulnérabilité des chondrocytes articulaires à différentes conditions environnementales et mécaniques contrôlées, ainsi que la projection de traitements visant à réduire la sensibilité des chondrocytes à une charge mécanique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites ci-dessus ont été utilisés avec succès pour visualiser viable blessés/morts et in situ des chondrocytes articulaires de joints de souris après prescrit des charges mécaniques ou les impacts. En particulier, nous avons été en mesure d’analyser la vulnérabilité mécanique des chondrocytes dans le cartilage articulaire intact de deux différentes articulations synoviales : l’articulation du genou (fémur distal) et l’épaule (humérus). Nos résultats représentatifs montre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Dr. Richard Waugh et Luis Delgadillo pour l’utilisation généreuse de leur pH-metre et l’osmomètre. En outre, les auteurs voudrais remercier Andrea Lee d’avoir contribué à l’élaboration initiale du système de test mécanique. Cette étude a été financée par les NIH P30 AR069655.
Materials
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
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